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水稻条斑病菌外泌蛋白smf1-1诱导水稻免疫机制初步解析

水稻条斑病菌外泌蛋白SMF1-1诱导水稻免疫机制初步解析

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作者：隋育容山东农业大学

学位级别：硕士

水稻是世界上近半人口的口粮,在农业生产中面临多种生物、非生物胁迫,其中细菌性条斑病是水稻生产中危害较重的细菌性病害之一,严重威胁水稻产量、品质。水稻病害防治主要以加强检疫、施用化学药剂为主。化学药剂对病原菌有直接杀伤作用... 详细信息

水稻是世界上近半人口的口粮,在农业生产中面临多种生物、非生物胁迫,其中细菌性条斑病是水稻生产中危害较重的细菌性病害之一,严重威胁水稻产量、品质。水稻病害防治主要以加强检疫、施用化学药剂为主。化学药剂对病原菌有直接杀伤作用,但也会毒害有益生物、污染环境,影响人类饮食健康。因此寻找和开发植物源或微生物源的绿色植物免疫激发子来替代传统化学药剂成为目前生物农药的发展方向。植物可通过细胞表面模式识别受体(PRR)识别病原菌相关分子模式(PAMP)并激活模式触发免疫(PTI)。PAMP类物质可诱导植物产生ROS爆发、胼胝质沉积、MAPKs磷酸化以及抗病基因上调表达等免疫反应,可作为免疫诱抗剂,通过调动植物自身免疫,抵抗病原菌侵染。本研究为解析病原菌与植物细胞在质外体空间前沿战场中的互作机理,对水稻ZH11叶片接种细菌性条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicol,Xoc)RS105菌株,抽提水稻叶片胞间液蛋白,并对胞间液蛋白进行质谱分析,鉴定到一些具有免疫激发活性的细菌外泌蛋白,并主要围绕smf1-1展开研究。smf1-1含有一个FGE-sulfatase结构域,其在动物中的同源蛋白为一类PAMP分子,能引发动物产生免疫反应,具有免疫激发活性。本研究旨在揭示外泌蛋白smf1-1在增强水稻抗病中的作用机理以及对条斑病菌RS105菌株生理生化性质和致病力的影响,研究结果如下:(1)本研究通过原核表达并纯化获得smf1-1蛋白,外源喷施在水稻叶片后接种RS105菌株,相比于阴性对照,病斑长度明显缩短。同时在外源转入smf1-1的转基因水稻上接种RS105菌株后,病斑长度相比于野生型也显著缩短,说明smf1-1不论外源喷施还是转入水稻都能增强水稻对条斑病的抗性。(2)本研究利用smf1-1喷施处理水稻叶片,定量结果显示防御相关基因Os PR2、Os PAL等上调表达,DAB和NBT染色检测到更强的活性氧爆发,苯胺蓝染色表明胼胝质沉积含量增加,同时还检测到MAPK磷酸化水平提高,以上结果说明smf1-1能诱导水稻产生经典免疫反应。(3)本研究比较了RS105野生型、突变体和回补菌株的趋化性、游动性、胞外纤维素酶活性、生物膜等生理生化性质。发现敲除smf1-1后菌株趋化性、游动性、胞外纤维素酶活性等理化性质都与野生型相似,但突变菌株生物膜合成减少,回补菌株部分恢复了野生型水平,以上结果说明smf1-1会影响RS105菌株生物膜的形成。(4)本研究比较了水稻ZH11接种RS105＿Δsmf1-1三个菌株后发病情况,发现接种突变菌株RS105＿Δsmf1-1后病斑长度增加,而回补菌株RS105＿Δsmf1-1(smf1-1)与野生型菌株RS105致病力相当,说明敲除smf1-1增强RS105菌株对水稻的致病力。(5)本研究通过酵母双杂交(Yeast Two-Hybrid,YTH)和双分子荧光互补实验(Bimolecular Fluorescence Complementation,Bi FC)证明smf1-1和Os AMBP1在体内互作。通过激光共聚焦显微镜观察到smf1-1和Os AMBP1的互作定位于细胞膜。综上所述,外泌蛋白smf1-1通过诱导水稻ROS爆发、胼胝质沉积、MAPK磷酸化以及抗病相关基因上调表达等一系列免疫反应,增强水稻对条斑病的抗性,并与水稻蛋白Os AMBP1互作。同时smf1-1参与RS105生物膜形成,且敲除smf1-1使RS105菌株对水稻的致病力增强。该研究表明,外泌蛋白smf1-1可能是一种新的蛋白类免疫激发子,可用于水稻条斑病绿色防治。

关键词： smf1-1 外泌蛋白激发子水稻细菌性条斑病菌

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