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smap-29抗菌肽的原核表达、纯化及活性检测

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生物技术通报 2013年第3期29卷 144-148页

作者：郑秋实段晨曦陶凤云北京联合大学生物化学工程学院北京100023

旨在利用基因工程技术表达出有活性的重组smap-29抗菌肽。根据大肠杆菌偏好的密码子优化smap-29基因序列,在目标肽序列N端添加肠激酶识别位点,C端添加终止密码子,化学合成基因序列,通过EcoR I和Hind III双酶切位点连接到pET-28a(+)上构... 详细信息

旨在利用基因工程技术表达出有活性的重组smap-29抗菌肽。根据大肠杆菌偏好的密码子优化smap-29基因序列,在目标肽序列N端添加肠激酶识别位点,C端添加终止密码子,化学合成基因序列,通过EcoR I和Hind III双酶切位点连接到pET-28a(+)上构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达重组蛋白,Ni-NTA亲和层析纯化,肠激酶切割后释放出smap-29抗菌肽,检测其抗菌活性。结果显示,带有6×His标签及肠激酶识别位点的smap-29重组融合蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式表达,利用Ni-NTA亲和层析可获得纯化的融合蛋白,肠激酶切割后释放出的smap-29重组抗菌肽对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白念珠菌的最小抑菌浓度依次为10、20和40μmol/L。

关键词：抗菌肽 smap-29 原核表达抗菌活性

Codon Optimization of smap-29 Gene and Its Expression in Pichia pastoris

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Agricultural Biotechnology 2012年第4期1卷 49-53页

作者： Yaojun REN Enpeng HE Xinhua WANG Xinwen BO Assets Department Xinjiang Normal University The Breed & Biotechnology Key Laboratory of Sheep in Reproduction & Construction Group of Xinjiang Key Laboratory of Sports Human Science Xinjiang Normal University

[ Objective] This study aimed to optimize the cedon of antimicrobial peptide smap-29 gene and express smap-29 in Pichia pastoris. [ Method] Ac- cording to the published amino acid sequence of smap-29, a gene encoding smap-29 （sheep myeloid antibacterial peptides-29） mature peptide was synthesized and was biased codon usage of Pichia pastoris. The synthesized gene was inserted into Pichia pastoris expression vector pPIC3.5K, transformed into Pichia pastoris strain GSll5 by electmporation, and screened with G418 for high-copy recombinants. The methanol utility plus phenotype （Mut ＋） was selected with MM, MD and PCR. The correctly constructed recombinant strain was induced with methanol. Expression of smap-29 was analyzed by lysing the induced yeast cells with Tricine- SDS-PAGE. [ Result] After induced with methanol for 2 d, a 3.2 kD induced band was detected in the cell lysate which was consistent to the predicted molecular weight of smap-29 ; the expression products purified with gel filtration chromatography showed significant antibacterial effect against Staphyloccocus aureus and Mo- nilia albican but no significant antibacterial effect against Escherichia coli. [ Conclusion] This study laid the foundation for the application of smap-29 in biomedi- cine, agriculture and other fields.

关键词： smap-29 Pichia pastoris Intracellular expression Antibacterial activity

抗菌肽smap-29基因密码子优化及其毕赤酵母表达载体构建

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畜牧与兽医 2008年第6期40卷 20-22页

作者：任耀军薄新文王新华石河子大学动物科技学院新疆石河子832000 新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室新疆石河子832000

以GenBank发表的绵羊骨髓抗菌肽(smap-29)基因(L46854)为模板,选择毕赤酵母偏好密码子,合成smap-29成熟肽基因。将合成的基因克隆入pPIC 3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC 3.5K-smap-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建... 详细信息

以GenBank发表的绵羊骨髓抗菌肽(smap-29)基因(L46854)为模板,选择毕赤酵母偏好密码子,合成smap-29成熟肽基因。将合成的基因克隆入pPIC 3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC 3.5K-smap-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。表达载体的正确构建为smap-29的高效表达和生物学活性研究奠定基础。

关键词： smap-29 密码子优化毕赤酵母载体构建

绵羊骨髓抗菌肽（smap-29）在毕赤酵母中表达的研究

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绵羊骨髓抗菌肽（SMAP-29）在毕赤酵母中表达的研究

作者：任耀军石河子大学

学位级别：硕士

抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的多肽,是生物体先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点而广受人们的关注。绵羊骨髓抗菌肽(smap-29)是1995年Bagella和Margherita Zanetti等研究小... 详细信息

抗菌肽是广泛存在于自然界生物体中的多肽,是生物体先天免疫的重要组成部分。因其具有抗菌活性强、广谱抗菌、热稳定性及不易产生耐药性等优点而广受人们的关注。绵羊骨髓抗菌肽(smap-29)是1995年Bagella和Margherita Zanetti等研究小组在绵羊的骨髓mRNA中发现的,具有两亲性α-螺旋结构域,属于cathelicidins家族,含29个氨基酸残基,有很强的抗细菌、真菌、中和内毒素等生物学功能。本研究以GenBank发表的smap-29基因(L46854)为模板,参照毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)密码子偏好性,设计合成了抗菌肽smap-29成熟肽目的基因片段。通过基因重组的方法将合成的基因克隆入pPIC3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-smap-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。将构建成功的载体电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。对构建好的重组酵母表达基因工程菌用甲醇诱导表达,裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的smap-29分子量相当,约为3.2KD的表达带。Trizol法提取酵母总RNA,通过RT-PCR扩增smap-29 mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在smap-29 mRNA,而对照没有检出,表明smap-29在毕赤酵母中存在表达。表达产物经凝胶过滤色谱处理后进行抑菌活性检测,结果表明该表达产物对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC2592)和白色念珠菌(Candida albicans ATCC2002)有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑制效果不明显。

关键词：抗菌肽 smap-29 毕赤酵母胞内表达

抗菌肽smap-29基因的设计、合成、表达纯化及抗菌活性的检测

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抗菌肽SMAP-29基因的设计、合成、表达纯化及抗菌活性的检测

作者：韩福郎南华大学

学位级别：硕士

目的：通过设计合成抗菌肽smap-29新基因，构建其原核表达载体pGEX-4T-1／smap-29，经诱导表达和分离纯化，得到大量具有抗菌活性的抗菌肽smap-29。方法：根据smap-29蛋白质氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，同时兼顾了其mRNA二... 详细信息

目的：通过设计合成抗菌肽smap-29新基因，构建其原核表达载体pGEX-4T-1／smap-29，经诱导表达和分离纯化，得到大量具有抗菌活性的抗菌肽smap-29。方法：根据smap-29蛋白质氨基酸序列，选用大肠杆菌偏爱密码子，同时兼顾了其mRNA二级结构自由能自行设计全新基因，基因采用geneSOEing(gene splicing by overlap extension，geneSOEing)法合成，合成的基因克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中，通过酶切分析、PCR和测序鉴定筛选出阳性重组质粒;重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达，经GST琼脂糖FF层析柱纯化，同时作凝血酶切割，再经HPLC分离纯化，获得纯度达95％的目的蛋白。检测抗菌肽smap—29的抗菌活性，采用微量肉汤稀释法测定其对白色葡萄球菌(临床株)、粪肠球菌耐药株(耐氟喹诺酮类)、粪肠球菌标准株(ATCC29212)和大肠杆菌(JM 109)的MIC和MBC值。结果：经geneSOEing法合成的全新基因长109bp(含限制性酶切位点)，将其克隆至pGEX-4T-1原核表达载体中，通过酶切分析、PCR和测序鉴定，其序列与所设计序列完全一致。SDS—PAGE电泳结果分析表明pGEX-4T-1／smap-29可以在BL21中表达大小约29KD的GST-smap-29融合蛋白，经凝血酶切割和分离纯化后得到大小约3.2KDa的smap-29目的多肽。微量肉汤稀释法检测表明smap-29具有较强的抗菌活性。

关键词：抗菌肽 smap-29 基因设计原核表达

利用SUMO融合技术在大肠杆菌中表达抗菌肽smap-29及其抗菌活性研究

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利用SUMO融合技术在大肠杆菌中表达抗菌肽SMAP-29及其抗菌活性研究

作者：万健陕西理工学院

学位级别：硕士

抗菌肽(Antibacterial peptides)是生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽,具有抵抗外界微生物侵害的作用,是生物天然免疫系统中的一个重要组成部分,与传统抗生素相比,抗菌肽具有热稳定好、水溶性好、强碱性、广谱抗菌和作用机制独特... 详细信息

抗菌肽(Antibacterial peptides)是生物体特定基因编码产生的一类小分子多肽,具有抵抗外界微生物侵害的作用,是生物天然免疫系统中的一个重要组成部分,与传统抗生素相比,抗菌肽具有热稳定好、水溶性好、强碱性、广谱抗菌和作用机制独特等特点。抗菌肽smap-29(sheep myeloid antibacterial peptides-29)是Bagella和Margherita Zanetti等从绵羊骨髓细胞中Cathelicidins前体蛋白的羧基端截取的29个氨基酸残基,具有两亲性?-螺旋结构,有很强的抗细菌、真菌、病毒等生物学功能。本实验根据smap-29的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏爱性,人工设计并合成了smap-29的基因片段,构建了重组表达载体pSUMO-smap-29;优化了融合蛋白SUMO-smap-29的诱导表达条件;在大肠杆菌BL21(DE3)中重组表达并分离纯化了融合蛋白SUMO-smap-29,同时也在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并分离纯化了能够切割SUMO标签的SUMO protease 1;SUMO protease 1成功切割融合蛋白SUMO-smap-29释放smap-29后,亲和层析法分离纯化得到了抗菌肽smap-29并测定其体外抗菌活性。主要实验结果如下:(1)经DNA测序验证,smap-29基因正确地克隆到pSUMO载体上,成功的构建重组表达载体pSUMO-smap-29;(2)在本实验中,SUMO-smap-29最优的诱导表达条件为:IPTG终浓度为0.5mM,诱导温度为30℃,诱导表达时间为3小时;(3)通过Ni柱亲和层析分别从1L诱导菌液中纯化得到16 mg融合蛋白SUMO-smap-29和115 mg的SUMO protease 1;(4)纸片琼脂扩散实验和最小抑菌浓度实验结果显示,抗菌肽smap-29对革兰氏阴性菌*** ATCC25922有明显的抑菌效果,且最小抑菌浓度为32μg/mL,对革兰氏阳性菌*** ATCC25923的抑菌效果不明显。

关键词：抗菌肽 smap-29 pSUMO SUMO protease 1 原核表达

抗菌肽smap-29在大肠杆菌中表达条件的优化及纯化研究

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江苏农业科学 2018年第9期46卷 44-47页

作者：吴三桥赵冠杰万健陈琛陕西理工大学生物科学与工程学院/中德天然产物研究所陕西汉中723000

将前期构建的含有pSUMO-smap-29的重组质粒转入宿主菌Escherichia coli BL21,对表达菌株的表达条件进行优化,考察诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白SUMO-smap-29表达的影响,用SDS-PAGE电泳、Quantity One及SPSS软件进行分析... 详细信息

将前期构建的含有pSUMO-smap-29的重组质粒转入宿主菌Escherichia coli BL21,对表达菌株的表达条件进行优化,考察诱导剂IPTG浓度、诱导温度和诱导时间对融合蛋白SUMO-smap-29表达的影响,用SDS-PAGE电泳、Quantity One及SPSS软件进行分析,并将融合蛋白通过Ni柱进行亲和纯化。研究结果表明,IPTG终浓度为0.50 mmol/L、诱导温度为30℃、诱导表达时间为3 h时融合蛋白的表达量最高,占菌体总蛋白的11.35%。确定重组融合蛋白SUMO-smap-29的最优表达条件并纯化得到融合蛋白SUMO-smap-29。

关键词：抗菌肽 smap-29 pSUMO 大肠杆菌原核表达

抗菌肽smap-29基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

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安徽农业科学 2012年第25期40卷 12386-12389页

作者：任耀军何恩鹏王新华薄新文新疆师范大学资产管理处新疆乌鲁木齐830054 新疆师范大学运动人体科学重点实验室新疆乌鲁木齐830054 新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室新疆石河子832000

[目的]对抗菌肽smap-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽smap-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽smap-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连... 详细信息

[目的]对抗菌肽smap-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽smap-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽smap-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的smap-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为smap-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。

关键词： smap-29 毕赤酵母胞内表达抑菌活性

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抗菌肽smap-29在毕赤酵母中的表达

石河子大学学报（自然科学版） 2008年第6期26卷 695-699页

作者：任耀军薄新文王新华新疆兵团绵羊繁育生物技术重点实验室新疆石河子832000 新疆师范大学资产处新疆乌鲁木齐830054

依据毕赤酵母密码子偏好性,设计合成抗菌肽smap-29成熟肽基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K上,SalI线性化后转化毕赤酵母GS115,418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导第2d... 详细信息

依据毕赤酵母密码子偏好性,设计合成抗菌肽smap-29成熟肽基因片段,克隆到表达载体pPIC3.5K上,SalI线性化后转化毕赤酵母GS115,418抗性筛选高拷贝克隆,再由酵母菌落PCR鉴定;阳性克隆用甲醇诱导表达,Tricine-SDS-PAGE分析,结果在诱导第2d的酵母裂解液中检测到与预期的smap-29分子量接近,约3.2kD的诱导表达带;Trizol法提取酵母总RNA,并通过RT-PCR扩增smap-29mRNA,发现表达期的酵母细胞中存在smap-29mRNA,而对照没有检出,表明smap-29在毕赤酵母中存在表达。

关键词： smap-29 毕赤酵母真核表达酵母菌落PCR