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TaC9-ABE系统介导的修复人SMN2基因的研究

TaC9-ABE系统介导的修复人SMN2基因的研究

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作者：彭晓华五邑大学

学位级别：硕士

脊髓性肌萎缩症(sma)是一种常染色体隐性疾病,主要表现为肌萎缩和进行性肌无力。sma患者将逐渐丧失运动能力,进而影响呼吸和吞咽,最终导致死亡,是婴幼儿最常见的致死性单基因遗传病。人群携带率高达1/50,在我国新生儿的患病率为1/10000... 详细信息

脊髓性肌萎缩症(sma)是一种常染色体隐性疾病,主要表现为肌萎缩和进行性肌无力。sma患者将逐渐丧失运动能力,进而影响呼吸和吞咽,最终导致死亡,是婴幼儿最常见的致死性单基因遗传病。人群携带率高达1/50,在我国新生儿的患病率为1/10000左右。有98%的sma患者是由于运动神经元生存基因1(SMN1)纯合缺失导致功能性全长SMN(SMN-FL)蛋白的缺乏引起的。人体内存在与SMN1基因高度同源的SMN2基因,它与SMN1的主要区别在于第7外显子的第6位由C·G转变为T·A,使第7外显子内的外显子剪接增强子转变为外显子剪接沉默子。因此,SMN2基因的表达产物多是不含外显子7的易降解截断型转录本,直接影响到运动神经元的逐步萎缩和死亡。尽管目前已有多种针对sma的治疗方法,包括小分子化合物治疗、反义核酸治疗、干细胞治疗、基因治疗以及神经和肌肉的保护疗法等,主要目标都是通过提高内源全长SMN2蛋白表达量或转入外源SMN1基因,保障运动神经元表达足量的全长SMN蛋白,维持运动神经元活性。但这些方法分别存在时效性、可操作性、安全性和有效性等缺陷,难以彻底治愈sma。近年来,基因编辑技术可实现直接修复内源SMN2基因7号外显子上第6位碱基T到C的转换,实现SMN蛋白正常表达,保障运动神经元正常存活和发挥功能。但目前的基因编辑治疗方案对7号外显子第6位碱基的编辑效率太低且具有脱靶编辑的可能,为sma疾病的治疗带来安全隐患。本课题首次将TaC9-ABE系统应用于sma的治疗。TaC9-ABE系统是一种双向导基因编辑器,包括表达类转录激活效应器(transcription activator-like effector,TALE),腺苷脱氨酶,sgRNA和nCas9蛋白。该系统具有安全、高效、编辑窗口宽等优势,可有效利用双重AAV实现基因治疗。本课题利用TaC9-ABE系统首先分别在HEK293T细胞中成功筛选出高效编辑人类SMN2基因外显子7的组合(TaC9-F4),编辑效率可达70%以上,远高于常规ABE编辑效果。进一步在U2OS和Hela细胞上也证实其基因编辑效果的可重复性。本课题还构建了多株SMN1基因突变的人类诱导多能干细胞系(sma-ipsc),用以模拟sma病人来源ipsc。TaC9-ABE系统可在sma-ipsc中实现高效精确修复SMN2基因(T6C),并且在可能的10个脱靶位点均未检测到基因编辑。基因修复的sma-ipsc在干细胞形态、多能性状态和核型等特征与正常干细胞一致且SMN2的7号外显子转录本含量增加。将SC-sma-ipsc分化为运动神经元后进一步检测发现SMN全长蛋白含量也有所提高,说明TaC9-ABE系统可安全有效地实现SMN2基因修复。综上所述,本课题首次利用TaC9-ABE系统建立了一套高效安全和精确的SMN2基因修复策略,并在ipsc上验证了其安全性和有效性。未来可进一步在小鼠或大动物sma模型上进行碱基编辑纠正SMN2基因,为人类sma疾病的治疗提供一个新型的安全高效和一劳永逸的解决方案。

关键词：脊髓性肌肉萎缩症 SMN1 SMN2 sma-ipsc TaC9-ABE系统

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