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壮族人硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征家系slc19a2基因一个新突变

壮族人硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征家系SLC19A2基因一个新突变

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作者：冼肖英广西医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的硫胺素响应性巨幼细胞贫血(thiamine-responsive megaloblastic anemia,TRMA)综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病,主要临床表现为:大细胞贫血、高血糖、逐渐加重的感觉神经性耳聋。此外,还有其他不常见的特征,包括类... 详细信息

研究背景和目的硫胺素响应性巨幼细胞贫血(thiamine-responsive megaloblastic anemia,TRMA)综合征是一种罕见的常染色体隐性遗传病,主要临床表现为:大细胞贫血、高血糖、逐渐加重的感觉神经性耳聋。此外,还有其他不常见的特征,包括类似中风发作、血小板减少、共济失调、心率失常、视网膜退行性变、身材矮小等。复杂多样的临床特征常导致TRMA被误诊误治。遗传分析发现TRMA的唯一致病基因为slc19a2基因,位于1q23.3,编码由497个氨基酸构成的多肽链硫胺素转运蛋白-1(thiamine transporter-1,THTR-1)。目前,在不同种族中,至少发现slc19a2基因45个突变位点可导致TRMA,多数为错义突变和无义突变,其次是插入突变和删除突变。硫胺素是生命体中必不可少的一种维生素。然而,人体缺乏合成硫胺素的能力,必须从外源食物中摄入。食物中获得的硫胺素磷酸酯,经肠道磷酸酯酶的作用,转变成游离状态的硫胺素,被小肠上皮细胞吸收。进入细胞的硫胺素在硫胺素焦磷酸激酶作用下被转化为硫胺素焦磷酸(thiamine pyrophosphate,TPP),成为糖代谢过程中关键酶(丙酮酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶、转酮醇酶)的辅酶,参与细胞能量代谢。我们对壮族一个TRMA家系进行基因突变分析,从基因水平确定该家系的致病原因,利用高效液相色谱仪检测先证者补充硫胺素前及补充硫胺素(30mg/d)3个月后的全血TPP相对浓度,为疾病诊断和治疗提供依据。方法收集壮族一个TRMA家系临床资料。根据临床资料对该家系成员slc19a2基因全部外显子及其侧翼序列进行突变分析。分离先证者及健康对照组外周血淋巴细胞,提取RNA,利用RT-PCR技术检测slc19a2基因mRNA的相对表达量。计算机分析预测THTR-1的跨膜区、保守性及三维结构。利用高效液相色谱仪检测健康对照组、先证者补充硫胺素前及补充硫胺素(30mg/d)3个月后的全血TPP相对浓度。结果对该家系成员slc19a2基因全部外显子及其侧翼序列进行突变分析,先证者slc19a2基因第6外显子存在c.1409insT纯合插入突变,父母及姐姐均为该位点杂合突变(C/T)携带者。RT-PCR检测结果显示先证者与健康对照组slc19a2基因mRNA的相对表达量无差异(P2mV*s,先证者补充硫胺素前的全血TPP相对浓度为2403mV*s,与健康对照组相比,差异具有统计学意义(P=0.000);先证者补充硫胺素(30mg/d)3个月后的全血TPP相对浓度为6185mV*s,与健康对照组相比,差异无统计学意义(P=0.203)。结论1.基因检测发现壮族人硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征家系slc19a2基因一个新突变c.1409insT。2.先证者全血硫胺素焦磷酸相对浓度明显减少,可能是由于硫胺素转运蛋白-1功能障碍导致。

关键词：硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征 slc19a2基因硫胺素转运蛋白-1 硫胺素焦磷酸

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作者：覃玉妹广西医科大学

学位级别：硕士

背景与目的:硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征(Thiamine-responsive megaloblastic anemia,TRMA)也称为罗杰斯综合征,是slc19a2基因突变导致的临床上罕见的常染色体隐性遗传病,其常见的临床表现为:巨幼细胞性贫血、糖尿病和感音神经性耳... 详细信息

背景与目的:硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征(Thiamine-responsive megaloblastic anemia,TRMA)也称为罗杰斯综合征,是slc19a2基因突变导致的临床上罕见的常染色体隐性遗传病,其常见的临床表现为:巨幼细胞性贫血、糖尿病和感音神经性耳聋。目前人类遗传学研究表明,TRMA唯一的致病基因是slc19a2基因,编码含有497个氨基酸的硫胺素转运蛋白-1(thiamine transporter-1,THTR-1)。slc19a2基因突变导致THTR-1缺陷,使其硫胺素转运和激活功能受损,细胞发生硫胺素缺乏,影响细胞的正常代谢,出现内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)反应及细胞凋亡现象,最终表现为巨幼细胞性贫血、糖尿病和感音神经性耳聋等临床症状。前期,我们在壮族人群中发现一个TRMA家系,同时发现并鉴定出该家系患儿存在slc19a2(c.1409ins T)位点纯合插入突变,该突变引起THTR-1蛋白C末端27位氨基酸处的移码突变,导致蛋白质翻译提前终止,THTR-1肽链不完整导致蛋白功能缺陷。先证者临床表现为巨幼细胞性贫血、糖尿病、双侧视网膜萎缩。其血液ERS相关通路的指标葡萄糖调节蛋白78(Glucose regulated protein 78,GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homoiogousprotein,CHOP)和活化转录因子4(Activating transcription factor4,ATF4)的m RNA表达量升高。因此,本研究拟从细胞水平探索THTR-1功能异常可通过ERS介导胰岛β细胞凋亡引发糖尿病的致病机制,4-苯基丁酸钠盐(Sodium phenylbutyrate,4-PBA)可能通过抑制胰岛β细胞ERS从而抑制糖尿病的治疗机制。方法:1.构建稳定过表达slc19a2野生型和slc19a2(c.1409ins T)突变型的大鼠胰岛癌细胞INS.1细胞系,实验分组为空载质粒转染组(对照组)、过表达slc19a2野生型组、过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组。利用qRT-PCR、Western Blot方法检测各组INS.1胰岛β细胞中slc19a2的m RNA及蛋白表达水平。2.细胞免疫荧光染色确定过表达slc19a2野生型组、过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组细胞中THTR-1蛋白的定位。3.利用成功构建的INS.1稳定细胞株进行qRT-PCR检测和Western Blot实验,分析ERS PERK通路相关信号分子蛋白激酶R样内质网激酶(Protein kinase R-like ER kinase,PERK)、GRP78、CHOP、真核起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α,e IF2α)、ATF4、B细胞白血病-淋巴瘤-2基因(B-cell leukemia-iymphoma-2,Bcl-2)的m RNA及蛋白表达水平。4.利用流式细胞仪检测空载质粒转染组、过表达slc19a2野生型组和过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组细胞的凋亡率,探讨slc19a2(c.1409ins T)突变对INS.1胰岛β细胞凋亡的影响。5.运用高效液相-质谱联用方法定量测定各组INS.1细胞中焦磷酸硫胺素的浓度。6.通过CCK8法检测各组INS.1胰岛β细胞的增殖及4-PBA对INS.1胰岛β细胞的细胞毒性并确定合适的给药浓度。7.通过qRT-PCR及Western Blot方法检测经过4-PBA处理12h、24h后,INS.1胰岛β细胞内质网应激反应PERK通路相关信号分子PERK、GRP78、CHOP、e IF2α、ATF4、Bcl-2的m RNA及蛋白表达水平。结果:***-PCR及Western Blot结果显示,慢病毒转染筛选后,过表达slc19a2野生型组和过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组中slc19a2基因的m RNA、蛋白表达水平显著高于对照组(P2.通过细胞免疫荧光染色检测,发现过表达slc19a2野生型组的THTR-1集中表达于细胞膜上,而过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组的THTR-1大部分表达在细胞核和细胞质中,仅有少量在细胞膜上表达。***-PCR结果表明,过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组与对照组、过表达slc19a2野生型组相比,其PERK、GRP78、CHOP、ATF4、e IF2α的m RNA表达水平显著上调,差异具有统计学意义;过表达slc19a2(c.1409ins T)突变型组Bcl-2的m RNA表达水

关键词：硫胺素响应性巨幼细胞贫血综合征 slc19a2基因硫胺素转运蛋白-1 内质网应激反应 4-苯基丁酸钠盐

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