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PKCα在TOCP抑制sk-n-sh细胞自噬中的作用及机制研究

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PKCα在TOCP抑制SK-N-SH细胞自噬中的作用及机制研究

作者：邓强南华大学

学位级别：硕士

目的:探讨PKCα在TOCP影响sk-n-sh神经细胞自噬的作用及机制。方法:***-n-sh细胞经TOCP(0 mmol/L)染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出sk-n-sh细胞暴露于TOCP(48 h)的半数抑制浓度(IC50),并确定后期实验的... 详细信息

目的:探讨PKCα在TOCP影响sk-n-sh神经细胞自噬的作用及机制。方法:***-n-sh细胞经TOCP(0 mmol/L)染毒,通过MTT法测定该化合物对细胞增殖的影响,并利用SPSS软件算出sk-n-sh细胞暴露于TOCP(48 h)的半数抑制浓度(IC50),并确定后期实验的染毒剂量。***-n-sh细胞经TOCP(0 mmol/L)染毒,通过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、pPKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTn、nBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、nF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。使用了透射电子显微镜观察自噬体的生成情况。***-n-sh细胞经PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理0.5 h后,0.75 mmol/L TOCP染毒48 h,过荧光分光光度仪测定细胞内蛋白酶体活性,Western blot检测PKCα蛋白、p-PKCα蛋白、自噬蛋白(P62、Beclin 1、LC3II/LC3I)、自噬受体蛋白(OPTn、nBR1)、细胞骨架蛋白(p-Tau、nF-H、MAP2)和泛素化蛋白(Ub)表达水平。免疫荧光法测定PKCα蛋白和自噬相关蛋白(LC3和P62)的蛋白表达水平来进一步验证WB的结果;结果:***数据表明,当sk-n-sh细胞暴露于TOCP(48 h)后,细胞生长形态发生改变以及增殖速度显著减慢。***-n-sh细胞暴露于TOCP(48 h)后,细胞内PKCα活性显著增加;用PKCα激活剂(PMA)和抑制剂(SP)预处理后再经TOCP染毒,发现激活剂能使TOCP所诱导的细胞内PKCα活性上升(Pn和nF-H水平下降(PnBR1水平上升(Pn,并累积了nBR1蛋白,从而抑制细胞自噬流。***通过激活PKCα活性降解骨架相关蛋白nF-H和p-Tau的累积。***通过激活PKCα使sk-n-sh细胞中蛋白酶体(Proteasome)活性降低,泛素化蛋白积聚,使泛素-蛋白酶体系统(UPS)受损,UPS功能障碍可以刺激自噬作为补偿途径。

关键词： sk-n-sh PKCα TOCP 蛋白酶体 UPS 自噬

Calpain在TOCP抑制sk-n-sh细胞自噬中的作用及机制研究

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Calpain在TOCP抑制SK-N-SH细胞自噬中的作用及机制研究

作者：朱家佳南华大学

学位级别：硕士

目的:本项目分别使用不同的钙离子通道抑制剂工具药和构建CAPnS1基因敲除sk-n-sh细胞模型(CAPnS1)来研究calpain在三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)引起sk-n-sh细胞自噬紊乱中的调节作用及机制。方法:1.利用CRISPR/C... 详细信息

目的:本项目分别使用不同的钙离子通道抑制剂工具药和构建CAPnS1基因敲除sk-n-sh细胞模型(CAPnS1)来研究calpain在三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)引起sk-n-sh细胞自噬紊乱中的调节作用及机制。方法:1.利用CRISPR/Cas9技术构建CAPnS1基因敲除sk-n-sh细胞系(CAPnS1)。***法检测TOCP(0、0.25、0.5、0.75、1 mmol/L)对野生型sk-n-sh细胞(CAPnS1)和突变型sk-n-sh细胞(CAPnS1)增殖的影响,确定TOCP使用浓度。***-n-sh细胞经Verapamil、2-APB、CsA预处理后,0.75mmol/L TOCP染毒,使用荧光分光光度计检测细胞内钙离子浓度变化和calpain活性变化,并用Western-blotting检测细胞中calpain和自噬相关蛋白水平。4.野生型sk-n-sh细胞(CAPnS1)和突变型sk-n-sh细胞(CAPnS1)经0.75 mmol/L TOCP染毒后,荧光分光光度计检测calpain活性和proteasome活性变化,Western-blotting检测calpain蛋白、自噬相关蛋白、细胞骨架蛋白及磷酸化蛋白及Ub蛋白水平。结果:1.利用CRISPR/Cas9技术构建CAPnS1sk-n-sh细胞,经基因测序表明CAPnS1sk-n-sh细胞系构建成功,并且CAPnS1蛋白、calpain1和calpain2蛋白水平明显降低。***检测显示,TOCP分别处理sk-n-sh细胞和CAPnS1sk-n-sh细胞48小时后,细胞增殖受到明显抑制。***能使sk-n-sh细胞中钙离子浓度和calpain活性增加;用Verapamil、2-APB和CsA预处理后再经TOCP染毒,发现三种抑制剂能够抑制TOCP所诱导的细胞内钙离子浓度和calpain活性上升趋势。同时,Western-blotting结果显示,TOCP能使细胞内calpain1、calpain2、LC3Ⅱ、P62水平增加;而使用三种抑制剂预处理后TOCP所诱导的calpain1、calpain2、LC3Ⅱ、P62蛋白水平上升趋势受到抑制。另外,与TOCP处理CAPnS1sk-n-sh细胞组相比,TOCP染毒CAPnS1sk-n-sh细胞后,细胞中calpain活性、calpain1和calpain2水平下降;同样LC3Ⅱ和P62水平降低,而beclin1水平增加。***处理能使两种细胞中Tau、P-Tau、nF-H、MAP2水平下降,P-MAP2、P-nF-H水平上升;与CAPnS1sk-n-sh细胞相比,CAPnS1sk-n-sh细胞中nF-H和MAP2水平上升,P-MAP2、P-nF-H水平下降,但Tau、P-Tau水平无明显变化。此外,TOCP处理能够抑制两种细胞proteasome(PGPH-L)活性,Ub蛋白水平增加;但与CAPnS1sk-n-sh细胞相比,CAPnS1sk-n-sh细胞proteasome(PGPH-L)活性升高,Ub蛋白水平下降。结论:***能够通过激活L-型钙离子通道、线粒体钙离子通道和内质网IP3R钙离子通道使sk-n-sh细胞内Ca浓度、calpain活性及表达增加升高;***能够使sk-n-sh细胞中beclin1水平下降,LC3-II和P62水平上升;自噬受体蛋白OPTn水平下降,nBR1水平上升,抑制细胞自噬;***可通过激活calpain活性从而诱导sk-n-sh细胞中骨架相关蛋白Tau、MAP2、nF-H降解。***能使sk-n-sh细胞中Proteasome活性降低,泛素化蛋白积聚。

关键词： sk-n-sh Tri-ortho-cresyl phosphate Calpain 自噬泛素蛋白酶体

p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致sk-n-sh细胞凋亡中的作用机制研究

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p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致SK-N-SH细胞凋亡中的作用机制研究

作者：李亚妮宁夏医科大学

学位级别：硕士

目的通过不同浓度甲醇染毒sk-n-sh细胞后,检测细胞活力、细胞凋亡情况、氧化应激水平以及相关因子(Calpain2、p35、p25、CDK5、p53)的基因与蛋白表达水平,探究p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致sk-n-sh细胞凋亡中的作用机制,为甲醇的神经毒... 详细信息

目的通过不同浓度甲醇染毒sk-n-sh细胞后,检测细胞活力、细胞凋亡情况、氧化应激水平以及相关因子(Calpain2、p35、p25、CDK5、p53)的基因与蛋白表达水平,探究p25-CDK5-p53信号通路在甲醇致sk-n-sh细胞凋亡中的作用机制,为甲醇的神经毒性提供一定的理论依据。方法选取体外培养的sk-n-sh细胞,采用不同浓度甲醇(0-2000mmol/L)分别染毒细胞24、48h,CCK-8法检测细胞活力,确定后续甲醇染毒浓度为0、250、750、1250mmol/L(对照、低、中、高甲醇浓度组),染毒时间为24h。染毒24h后,显微镜观察细胞形态;Annexin V-FITC双染检测细胞凋亡;活性氧(ROS)试剂盒检测ROS水平;RT-PCR技术检测Calpain2、CDK5、p35、p25、p53的基因表达水平;Western blot检测Calpain2、CDK5、p25、p35、p53及p53磷酸化蛋白表达水平。结果1.甲醇染毒24、48h后,细胞活力均分别从(100.00±0.00)%下降至(16.03±0.72)、(9.66±0.37)%,差异具有统计学意义(Pn2、CDK5、p25高浓度组显著高于对照组、低、中浓度组(P0.05)。6.甲醇染毒24h后,蛋白表达量Calpain2、CDK5、p53-Ser15低浓度组高于对照组(Psk-n-sh细胞活力。2.甲醇可以改变sk-n-sh细胞形态。3.甲醇可以诱导sk-n-sh细胞发生凋亡。4.甲醇可以诱导sk-n-sh细胞发生氧化应激损伤反应,进一步激活钙激活中性蛋白酶Calpain2,使p35、p25及CDK5蛋白表达水平增加,进而引起p53蛋白积聚及其磷酸化,最终诱导sk-n-sh神经细胞发生凋亡。

关键词：甲醇 sk-n-sh 细胞凋亡氧化应激 p25-CDK5-p53

荜拔酰胺衍生物抗肿瘤活性评价及抗sk-n-sh细胞作用机制研究

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荜拔酰胺衍生物抗肿瘤活性评价及抗SK-N-SH细胞作用机制研究

作者：王令郑州大学

学位级别：硕士

荜拔酰胺最早发现于胡椒科植物荜拔的根部,据文献报道它能够提高肿瘤细胞内的活性氧水平,进而杀伤肿瘤细胞。因为荜拔酰胺对正常细胞的损伤作用小,受到药物研究人员的关注。但是由于荜拔酰胺具有溶解性低,作用靶点不明的缺点,因此本课... 详细信息

荜拔酰胺最早发现于胡椒科植物荜拔的根部,据文献报道它能够提高肿瘤细胞内的活性氧水平,进而杀伤肿瘤细胞。因为荜拔酰胺对正常细胞的损伤作用小,受到药物研究人员的关注。但是由于荜拔酰胺具有溶解性低,作用靶点不明的缺点,因此本课题组合成了一系列的荜拔酰胺衍生物并对衍生物进行活性评价及其作用机制的探讨,以期改善不足,获得活性更好,作用机制明确的抗肿瘤化合物。本研究论文的主要内容如下:选用MTT比色法对合成的51个荜拔酰胺衍生物进行体外抗肿瘤活性筛选,涉及的肿瘤细胞株有:SGC7901,MGC803,EJ,EC109和sk-n-sh,首先对所有化合物进行粗筛,将得到的活性较好化合物进行3次细筛。研究结果表明对5种肿瘤细胞48 h IC50小于1μM的衍生物有2个,1～5μM的有11个,5～20μM的有3个。在所有衍生物中PL-C21对sk-n-sh的活性最突出,48 h IC50是280nM,是荜拔酰胺抗sk-n-sh活性的10倍。对筛选最优化合物PL-C21进行了sk-n-sh抗癌机制研究。采用染色法观察凋亡小体,流式细胞术检测细胞周期、凋亡、活性氧和线粒体膜电位水平,蛋白质免疫印迹法检测与活性氧有关信号通路的蛋白,探索该化合物抗sk-n-sh细胞的作用机制。染色实验观察到早期凋亡细胞核皱缩,有的呈新月形紧挨着核膜;晚期凋亡细胞核破裂,呈大小不等圆形凋亡小体。流式细胞术检测PL-C21将sk-n-sh细胞阻滞于G2/M期;PL-C21诱导sk-n-sh细胞凋亡,并且相同的时间下凋亡率随着PL-C21浓度的增加而增加;PL-C21能够升高sk-n-sh细胞内活性氧水平和降低线粒体膜电位。当加入活性氧抑制剂氮乙酰谷胱甘肽(nAC)后,能够逆转PL-C21引起的肿瘤细胞形态,周期,凋亡,活性氧和线粒体膜电位的变化。蛋白质免疫印迹实验检测PL-C21对sk-n-sh细胞信号通路的影响。PL-C21杀伤sk-n-sh细胞在相同的时间随着药物浓度的增加促凋亡蛋白Bax、Bad表达量增加;活化后的Caspase3,Caspase9蛋白表达量增加;Caspase3的底物Active-PAPR蛋白表达量增加。因为ROS的产生与p38 MAPK有关。因此实验中加入p38 MAPK信号通路的特异性抑制剂SB62005后,用流式细胞术检测细胞内ROS水平及p38蛋白磷酸化水平被部分逆转。所以,PL-C21杀伤肿瘤细胞可能与激活了MAPK通路有关。综上所述,通过活性筛选得到的最优化合物PL-C21具有诱导sk-n-sh细胞凋亡,阻滞细胞周期,引起活性氧升高,使线粒体膜电位下降,并且激活了线粒体内部凋亡通路和MAPK通路。

关键词：荜拔酰胺衍生物 sk-n-sh 活性氧凋亡 MAPK

桑枝提取物抑制miR-369对sk-n-sh细胞损伤的影响

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新中医 2020年第23期52卷 1-6页

作者：黄宁宁吴恩辉童春南金华市第二医院精神科浙江金华321000

目的:探讨桑枝提取物对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^+)处理的sk-n-sh细胞损伤的影响及分子机制。方法:将sk-n-sh细胞随机分为对照组(未作任何处理)、模型组(2.5 mmol/L MPP^+)、低、中、高剂量药物组(20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L桑... 详细信息

目的:探讨桑枝提取物对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP^+)处理的sk-n-sh细胞损伤的影响及分子机制。方法:将sk-n-sh细胞随机分为对照组(未作任何处理)、模型组(2.5 mmol/L MPP^+)、低、中、高剂量药物组(20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L桑枝提取物+2.5 mmol/L MPP^+)、阳性对照给药组(50μmol/L司来吉兰+2.5 mmol/L MPP^+)、anti-miR-nC组(转染miR-369抑制阴性对照剂+2.5 mmol/L MPP^+)、anti-miR-369组(转染miR-369抑制剂+2.5 mmol/L MPP^+)、高剂量药物+antimiR-nC组(转染miR-369抑制剂阴性对照剂+60μmol/L桑枝提取物+2.5 mmol/L MPP^+)、高剂量药物+anti-miR-369组(转染miR-369抑制剂+60μmol/L桑枝提取物+2.5 mmol/L MPP^+)。细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡,蛋白质印迹(Western blot)法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase3)蛋白表达,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-1β(IL-1β)水平,试剂盒检测细胞中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-369和蛋白激酶B1(AKT1)mRnA的表达水平;将AKT1野生型和突变型荧光素酶表达载体分别与miR-nC和miR-369共转染至细胞sk-n-sh中,用荧光素酶报告实验检测miR-369和AKT1的靶向关系。结果:MPP^+处理的sk-n-sh细胞中细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,Caspase3表达水平升高,IL-1β水平升高,MDA含量升高,SOD活性降低,miR-369表达水平升高,AKT1 mRnA表达水平降低(PnA表达水平升高(Psk-n-sh细胞损伤的保护作用。miR-369靶向调控AKT1。结论:桑枝提取物可抑制MPP^+诱导的sk-n-sh细胞凋亡、炎症反应及氧化应激,可能通过调控miR-369/AKT1对MPP^+诱导的sk-n-sh细胞损伤起保护作用。

关键词：桑枝提取物帕金森病 miR-369 蛋白激酶B1 sk-n-sh 凋亡炎症因子氧化应激

蜂斗菜素抑制人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh增殖作用机制研究

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神经药理学报 2011年第3期1卷 1-6,22页

作者：程月芳王彩芳李文杰林青张旗郑州大学药学院

目的:探讨蜂斗菜素(petasin)对人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh增殖抑制作用的机制。方法:采用罗丹明B(SRB)法检测蜂斗菜素对肿瘤细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞术观察蜂斗菜素对sk-n-sh细胞周期和凋亡的影响;采用Hoechst 33258染色法观察... 详细信息

目的:探讨蜂斗菜素(petasin)对人神经母细胞瘤细胞sk-n-sh增殖抑制作用的机制。方法:采用罗丹明B(SRB)法检测蜂斗菜素对肿瘤细胞的增殖抑制作用;采用流式细胞术观察蜂斗菜素对sk-n-sh细胞周期和凋亡的影响;采用Hoechst 33258染色法观察蜂斗菜素对sk-n-sh凋亡的影响;蛋白免疫印迹法(WesternBlotting)检测蜂斗菜素对sk-n-sh细胞ERK1/2蛋白磷酸化的影响。结果:蜂斗菜素对sk-n-sh,SGC7901,SPC-A-1,SMMC 7721,Ec9706,sk-n-BE(2)和U251细胞有不同程度的抑制作用。蜂斗菜素使sk-n-sh细胞的周期阻滞于G0/G1期,但不诱导其凋亡,且下调ERK1/2蛋白的磷酸化水平。结论:蜂斗菜素是一种潜在的抗肿瘤天然化合物,其机制为抑制细胞增殖,但不诱导其凋亡。其分子机制可能包括下调ERK1/2蛋白的磷酸化水平。

关键词：蜂斗菜素 sk-n-sh 细胞增殖 ERK1/2

实时荧光定量分析sk-n-sh细胞中β-actin mRnA的半衰期

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温州医学院学报 2006年第4期36卷 313-316页

作者：胡昕吕建新温州医学院细胞与分子生物研究所浙江温州325035

目的:探讨和分析sk-n-sh细胞中β-actinmRnA的半衰期。方法:建立包含β-actin基因片断的pMD-T载体的梯度稀释曲线,应用VIC标记的Taqman-MGB探针进行检测,用Opticon2.02软件分析结果。以不同浓度和不同时间的放线菌素D阻断sk-n-sh细胞转... 详细信息

目的:探讨和分析sk-n-sh细胞中β-actinmRnA的半衰期。方法:建立包含β-actin基因片断的pMD-T载体的梯度稀释曲线,应用VIC标记的Taqman-MGB探针进行检测,用Opticon2.02软件分析结果。以不同浓度和不同时间的放线菌素D阻断sk-n-sh细胞转录,提取总RnA并予荧光定量RT-PCR检测β-actinmRnA。结果:sk-n-sh细胞中β-actinmRnA的半衰期为4h。与未处理组相比,4h组β-actin的拷贝数差异有显著性(Pn拷贝数差异有极显著性(Pn拷贝数的影响差异不大(P>0.05)。结论:应用实时荧光定量RT-PCR,通过比较mRnA与总RnA的拷贝数,建立了一种准确方便地检测mRnA衰减的方法。同时β-actin不适合做放线菌素D处理实验中的内参照。

关键词：实时荧光定量 sk-n-sh β-actin mRnA 半表期放线菌素D

Bcl-2反义核酸对sk-n-sh细胞增殖和凋亡的影响

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中国实用神经疾病杂志 2013年第17期16卷 35-36页

作者：张艳艳张晓艳付旭东周少龙王新军郑州大学基础医学院病理生理学教研室郑州450001 郑州大学第五附属医院神经外科郑州450052

目的研究Bcl-2反义核酸对人神经母细胞瘤细胞株sk-n-sh的增殖和凋亡的作用。方法设Bcl-2反义核酸ASODn组、正义核酸SODn组、脂质体组及空白对照组。MTT法检测Bcl-2反义核酸对sk-n-sh细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋... 详细信息

目的研究Bcl-2反义核酸对人神经母细胞瘤细胞株sk-n-sh的增殖和凋亡的作用。方法设Bcl-2反义核酸ASODn组、正义核酸SODn组、脂质体组及空白对照组。MTT法检测Bcl-2反义核酸对sk-n-sh细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况。结果 ASODn组72h细胞增殖抑制率达(68.24±2.41)%,较空白对照组差异显著(Pn可使sk-n-sh细胞周期阻滞于G2/M期,72h细胞凋亡率达(23.25±2.34)%。结论 Bcl-2反义核酸可抑制sk-n-sh细胞增殖并诱导其发生凋亡。

关键词： Bcl-2 反义核酸人神经母细胞瘤 sk-n-sh 凋亡

多溴联苯醚诱导人神经sk-n-sh细胞调亡的机理

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多溴联苯醚诱导人神经SK-N-SH细胞调亡的机理