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盐霉素抑制人肝癌sk-hep1细胞增殖机制的研究

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中国临床药理学杂志 2019年第19期35卷 2306-2309页

作者：杜娟吴博米志宽史海燕赵菊梅延安大学医学院

目的研究盐霉素对人肝腹水腺癌细胞(sk-hep1)增殖的影响及可能的作用机制。方法以二甲基亚砜处理的sk-hep1细胞为对照组,5,10,15μmol·L-1盐霉素处理的sk-hep1细胞为低、中、高剂量实验组。以显微镜观察各组sk-hep1细胞形态的变化;以... 详细信息

目的研究盐霉素对人肝腹水腺癌细胞(sk-hep1)增殖的影响及可能的作用机制。方法以二甲基亚砜处理的sk-hep1细胞为对照组,5,10,15μmol·L-1盐霉素处理的sk-hep1细胞为低、中、高剂量实验组。以显微镜观察各组sk-hep1细胞形态的变化;以细胞计数法(CCK-8)检测各实验组细胞的增殖抑制情况;以流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况;以相对实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测各组细胞凋亡相关基因和蛋白的表达量。结果低、中、高剂量实验组24 h的增殖抑制率分别为(32.73±8.47)%,(38.25±1.46)%和(41.68±0.05)%,48 h的抑制率分别为(42.52±2.50)%,(46.16±2.08)%和(53.99±1.27)%,实验组sk-hep1细胞增殖抑制率随着盐霉素浓度增加和作用时间的延长逐渐升高。对照组和低、中、高剂量实验组细胞早期凋亡率分别为(14.72±1.12)%,(23.37±2.70)%,(32.68±3.99)%和(40.41±4.66)%,晚期凋亡率分别为(6.56±3.26)%,(5.54±3.32)%,(7.35±3.75)%和(10.88±5.76)%,实验组sk-hep1早期凋亡率随着盐霉素浓度的提高而增加(P细胞所占比例无显著变化。低、中、高剂量实验组caspase-3的相对表达量为12.22±0.81,48.09±9.32,40.58±4.58,caspase-9的相对表达为1.40±0.09,1.62±0.33,1.88±0.43,与对照组(1.00±0.00)相比,差异均有统计学意义(均P0.05)。中、高剂量实验组caspase-8的相对表达量为2.21±0.77,6.13±1.35,Bax的相对表达量为2.92±0.60,1.69±0.23,Bcl-2的相对表达量为0.51±0.05,0.18±0.14,与对照组(1.00±0.00)相比,差异均有统计学意义(均Psk-hep1细胞发生早期凋亡,其对sk-hep1细胞的凋亡诱导作用与caspase-3基因表达的增加相关。

关键词：盐霉素 sk-hep1细胞增殖抑制凋亡

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重组诱导性质粒Egr1-XPO4的构建及其与5-FU联合对肝癌细胞sk-hep1的协同抑制作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 2018年第2期25卷 132-136页

作者：吴楠黄静陈阳刘侃刘好王晓梅深圳大学医学部广东深圳518000 深圳市南山区疾病预防控制中心广东深圳518000 深圳中生健康产业集团广东深圳518000

目的:构建重组诱导性质粒Egr1-XPO4,探讨其与5-FU联合对肝癌细胞sk-hep1的协同抑制作用。方法:将XPO4基因插入带诱导性启动子Egr1的质粒载体中,构建Egr1-XPO4重组质粒。将Egr1-XPO4质粒转染肝癌细胞sk-hep1并经化疗药物5-FU诱导,采用Wes... 详细信息

目的:构建重组诱导性质粒Egr1-XPO4,探讨其与5-FU联合对肝癌细胞sk-hep1的协同抑制作用。方法:将XPO4基因插入带诱导性启动子Egr1的质粒载体中,构建Egr1-XPO4重组质粒。将Egr1-XPO4质粒转染肝癌细胞sk-hep1并经化疗药物5-FU诱导,采用Western blotting检测转染细胞中XPO4蛋白表达水平,CCK法检测转染诱导后sk-hep1细胞的增殖水平,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测sk-hep1细胞凋亡情况。动物实验观察Egr1-XPO4质粒联合5-FU对裸鼠移植瘤的治疗效果。结果:成功构建携XPO4基因和启动子Egr1的重组诱导性质粒Egr1-XPO4,重组质粒转染sk-hep1细胞并经5-FU诱导后,细胞中XPO4蛋白表达量明显增加,且与5-FU的质量浓度明显依赖。Egr1-XPO4转染联合5-FU诱导对sk-hep1细胞增殖抑制明显强于单纯转染或5-FU诱导(Psk-hep1细胞的早期凋亡率显著高于单纯转染或诱导(P细胞sk-hep1产生协同抑制作用。

关键词：肝癌 sk-hep1细胞 XPO4基因 Egr1启动子 5-氟尿嘧啶协同作用

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端粒酶线粒体转位与肝癌细胞多药耐药的相关性研究

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肿瘤 2012年第1期32卷 7-15页

作者：文蕾凌贤龙周源第三军医大学新桥医院消化科重庆400038

目的:本研究旨在观察人端粒酶(human telomerase)线粒体转位对肿瘤多药耐药的影响。方法:分别采用顺铂(cisplatin,CDDP)大剂量冲击和间歇诱导的方法处理人肝癌sk-hep1细胞株,建立具有不同程度耐药指数(resistance index,RI)的人肝癌耐... 详细信息

目的:本研究旨在观察人端粒酶(human telomerase)线粒体转位对肿瘤多药耐药的影响。方法:分别采用顺铂(cisplatin,CDDP)大剂量冲击和间歇诱导的方法处理人肝癌sk-hep1细胞株,建立具有不同程度耐药指数(resistance index,RI)的人肝癌耐药细胞株;采用CCK-8(cell counting kit-8)法检测各组细胞的药物敏感性,计算半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)和RI;FCM法检测细胞周期及凋亡率;免疫荧光染色检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在细胞核和线粒体中的分布;蛋白质印迹法检测hTERT蛋白在全细胞和线粒体中的表达情况;实时定量基因扩增荧光检测系统(real-time quantitative PCR detecting system,Q-PCR)检测sk-hep1亲本细胞株和各耐药细胞株的端粒相对长度;实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的氧化损伤;JC-1染色法检测线粒体的膜电位。结果:获得3株对CDDP具有不同程度RI的sk-hep1细胞,分别命名为sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3细胞,CCK-8检测结果显示,它们对CDDP的RI值分别为7.51、9.31和13.76,并对多柔比星和5-氟尿嘧啶有交叉耐药作用。FCM法、免疫荧光染色法、Q-PCR系统、RFQ-PCR法及JC-1染色法的检测结果显示,随着RI值的增加,各耐药细胞株的凋亡率明显降低,hTERT逐渐从细胞核转位到了线粒体中,细胞中的端粒明显缩短,损伤的mtDNA逐渐减少,线粒体膜电位降低。结论:多药耐药肿瘤细胞中端粒酶线粒体转位增加,线粒体端粒酶可发挥保护线粒体的作用。肿瘤细胞通过端粒酶的线粒体保护功能抵抗凋亡。因此,端粒酶线粒体转位可能是肿瘤细胞多药耐药的另一重要的作用机制。

关键词：肝肿瘤抗药性,多药端粒线粒体 sk-hep1细胞

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端粒酶线粒体转位与人肝癌细胞多药耐药关系的实验研究

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端粒酶线粒体转位与人肝癌细胞多药耐药关系的实验研究

作者：文蕾第三军医大学

学位级别：硕士

背景与目的：原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，恶性程度高、手术切除率低。因此，化疗在肝癌的综合治疗中占重要的地位。但肝癌全身化疗的效果较差，肿瘤细胞多药耐药(multidrug resistance，MDR)是导致肝癌化疗失败的主要原因... 详细信息

背景与目的：原发性肝癌是最常见的消化系统肿瘤之一，恶性程度高、手术切除率低。因此，化疗在肝癌的综合治疗中占重要的地位。但肝癌全身化疗的效果较差，肿瘤细胞多药耐药(multidrug resistance，MDR)是导致肝癌化疗失败的主要原因之一。 MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药的同时，对其他结构及作用机制不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药的现象。MDR的发生机制比较复杂，包括增加药物外排、减少药物吸收、抗肿瘤药物靶位改变、药物活化作用减弱、DNA损伤修复能力增强及抗凋亡相关通路的改变等多个方面。线粒体一个非常重要的细胞器：为机体活动提供能量、调控氧化还原、调节钙离子浓度、介导细胞内信号传递等，尤其是调节细胞凋亡和坏死，线粒体担负着关键性作用。而细胞凋亡即是化疗药杀伤肿瘤细胞的共同通路。线粒体已成为筛选新型抗肿瘤药物的靶点之一。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，主要由3个亚单位构成，即端粒酶RNA(telomeraseRNA, TR)、端粒酶相关蛋白质(telomerase-associated protein, TP1/TP2)和端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)。研究表明, hTERT表达水平随着端粒酶活性增加而相应成比例增加。hTERT是人类端粒酶活性的主要调控亚单位。端粒酶在正常人体组织表达呈阴性或阳性率很低，而在生殖细胞、胚胎干细胞和癌细胞中高表达，其主要功能是维持端粒的长度。端粒酶活性高表达参与了肿瘤发生、发展的过程。端粒酶也可能通过拮抗细胞凋亡等作用参与肿瘤细胞MDR发生。过度表达TERT可能传递化疗药物抵抗信号。端粒酶主要存在于细胞核。研究发现，端粒酶除了维持端粒长度的功能外，还具有非依赖端粒的功能，如氧化应激和药物治疗可导致端粒酶从细胞核转位到线粒体并保护线粒体功能(保护线粒体DNA、降低线粒体ROS等)并抵抗凋亡，而不能保护细胞核内的端粒，端粒继续缩短。由此推断，当肿瘤细胞接触化疗药物时，端粒酶可能从细胞核内移位到线粒体发挥线粒体保护作用，抵抗凋亡。因此，端粒酶线粒体转位可能是肿瘤细胞发生MDR的另一机制。本研究通过建立不同耐药程度的人肝癌耐药细胞系sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3细胞，探讨端粒酶线粒体转位在肿瘤多药耐药过程中可能作用，期望为多药耐药逆转提供新的干预手段。研究方法：本研究分两部分：第一部分：体外培养人肝癌细胞株sk-hep1，采用大剂量冲击，间歇诱导法，用顺铂诱导sk-hep1细胞耐药后，用极限稀释法克隆筛选，建立不同耐药程度的人肝癌耐药细胞系sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3细胞。倒置显微镜比较耐药细胞和亲本细胞形态，细胞计数法比较耐药细胞和亲本细胞的生长曲线;CCK-8法检测亲本细胞株和耐药细胞株对不同浓度的抗肿瘤药物的药物敏感性，计算半数抑制率(IC50)和耐药指数(RI);流式细胞仪检测sk-hep1和sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2、sk-hep1/CDDP3的细胞周期。第二部分：免疫荧光染色及Western blot作hTERT在线粒体和细胞核的共定位分析。适时荧光定量PCR检测线粒体DNA氧化损伤及细胞端粒长度。采用荧光探针JC-1检测线粒体膜电位的变化。流式细胞仪检测sk-hep1和sk-hep1/CDDP1、 sk-hep1/CDDP2、sk-hep1/CDDP3的细胞凋亡率。研究结果： 1.耐药细胞sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3细胞形态基本接近亲本细胞。 2.与亲本细胞相比，耐药细胞sk-hep1/CDDP1、 sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3生长缓慢,差异具有统计学意义(Psk-hep1细胞IC50为5.42±0.04μg/mL，耐药细胞sk-hep1/CDDP1、sk-hep1/CDDP2和sk-hep1/CDDP3细胞IC50分别为40.72±0.06μg/mL、50.48±1.02μg/mL、70.61±1.06μg/mL，耐药指数分别为7.51、9.31、13.03，耐药细胞对氟尿嘧啶(5-FU)、阿霉素(DOX)等抗肿瘤药物显示交叉耐药(P细胞周期检测显示，耐药细胞G2/M和S期所占比例较亲本细胞增加，G1期所占比例减少，两组相比差异均有统计学意义(P细胞核转位到线粒体(P细胞端粒长度缩短;线粒体DNA损伤降低(P细胞的线粒体膜电位

关键词：肝癌多药耐药 sk-hep1细胞端粒酶端粒线粒体