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sirt1亚细胞定位对缺氧引发结直肠癌细胞凋亡的影响及其初步机制研究

SIRT1亚细胞定位对缺氧引发结直肠癌细胞凋亡的影响及其初步机制...

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作者：崔竹青中国人民解放军空军军医大学

学位级别：硕士

作为临床上最常见的一种恶性肿瘤,结直肠癌已经成为世界第三大高发的恶性肿瘤。由于缺乏早期诊断以及高效筛查的方法,半数以上的患者确诊时已发展至肿瘤晚期,预后较差,致死率位居世界第三位。尽管随着手术技术的不断发展、各种化疗和靶... 详细信息

作为临床上最常见的一种恶性肿瘤,结直肠癌已经成为世界第三大高发的恶性肿瘤。由于缺乏早期诊断以及高效筛查的方法,半数以上的患者确诊时已发展至肿瘤晚期,预后较差,致死率位居世界第三位。尽管随着手术技术的不断发展、各种化疗和靶向药物的研制,使结直肠癌患者的预后有所提高,但是从远期生存来看,患者的中位生存期仅约为18至22个月。因此,深入揭示结直肠癌发生和发展的分子机制是至关重要的。结直肠癌属于实体瘤,因其内部血管结构和功能的异常可导致肿瘤细胞血供和氧供减少,同时随着肿瘤细胞的迅速增殖常引发耗氧量增加,使肿瘤组织内部常常形成缺氧性肿瘤微环境,该微环境对肿瘤细胞的生物学具有重要影响,肿瘤细胞为了适应缺氧,不得不发生适应性改变并调整其生物学行为,最终促进其恶性转化。沉默信息调节因子1(silencing information regulator 1,sirt1)作为一种去乙酰化酶,主要通过烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD)影响组蛋白和非组蛋白的乙酰化状态,调控其下游信号通路,在细胞增殖、分化、凋亡、衰老以及应激等等诸多生物学过程中发挥重要作用。近来研究表明,sirt1在肿瘤的发生和进展中具有重要的作用,但是对sirt1是肿瘤抑制因子还是肿瘤促进因子目前仍然存在很大争议,导致这种相悖结果的原因之一可能与sirt1的亚细胞定位有关。已知sirt1能够在细胞质和细胞核之间动态穿梭,该穿梭能力分别受它的两个核定位序列(nuclear localization sequences,NLSs)和两个核输出序列(nuclear export sequences,NESs)的调控。细胞质和细胞核定位的sirt1均具有去乙酰化作用,不同亚细胞定位的sirt1可能通过调控不同的细胞内信号通路,影响肿瘤的发生和进展。鉴于缺氧性肿瘤微环境常引发结直肠癌细胞凋亡,本研究拟利用人类结肠癌细胞系HCT116和SW480作为研究对象,探究sirt1亚细胞定位在缺氧环境中是否发生改变?该变化是否影响结直肠癌细胞凋亡?同时对其相关分子机制进行初步研究。第一部分实验:为了探究sirt1亚细胞定位在缺氧环境中是否发生改变,我们首先收集了217例结直肠癌患者的肿瘤组织进行sirt1免疫组织化学染色,通过Kaplan-Meier生存分析对sirt1细胞核或细胞质表达水平与患者总生存和无疾病生存进行了分析,发现sirt1细胞质表达与患者无疾病生存具有统计学意义(P=0.007),sirt1细胞质高表达组的结直肠癌患者无疾病生存期显著延长。随后,我们对HCT116和SW480细胞株分别进行6 h、12 h和24 h缺氧处理并提取细胞总蛋白、细胞质蛋白和细胞核蛋白,western blot结果证实缺氧抑制sirt1的蛋白水平,并发现随着缺氧时间延长,sirt1在细胞核中逐渐增多,在细胞质中逐渐减少;sirt1的免疫荧光染色也证实:随着缺氧时间逐渐延长,sirt1在细胞核表达逐渐增多。最后,我们利用浓度梯度的LY294002(一种PI3K抑制剂,也是sirt1非特异性细胞核定位抑制剂)处理结直肠癌细胞,western blot检测发现:LY294002处理不影响常氧培养的结直肠癌细胞sirt1表达,但在缺氧条件下,30μM或50μM LY294002处理导致sirt1在细胞质显著升高(P(27)0.05)、在细胞核显著下降(P(27)0.01),同时细胞总蛋白sirt1、Akt、p-Akt显著下降;免疫荧光染色显示LY294002及缺氧处理导致HCT116细胞的sirt1荧光表达强度下降,阳性荧光着色主要位于细胞质。第一部分实验结果表明:缺氧抑制结直肠癌细胞sirt1蛋白水平,诱导肿瘤细胞sirt1发生细胞核转位,使其富集于细胞核中;PI3K抑制剂LY294002能够抑制细胞质sirt1入核,部分逆转缺氧引发的sirt1细胞核富集。第二部分实验:为了明确缺氧环境中sirt1亚细胞定位改变是否影响结直肠癌细胞凋亡,我们将具有编码过表达野生型sirt1、NLS突变型sirt1(sirt1)的慢病毒载体分别转染HCT116和SW480细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型sirt1细胞株(简称sirt1细胞)和NLS突变型sirt1细胞株(简称sirt1细胞),western blot检测显示过表达野生型sirt1位于细胞核和细胞质中,突变NLSs序列导致sirt1富集于细胞质中,支持NLSs序列是影响sirt1亚细胞定位的关键因素。随后进行的流式细胞术细胞凋亡检测和CCK-8细胞毒性实验结果显示过表达野生型sirt1抑制肿瘤细胞对缺氧的耐受力、细胞凋亡增多,而过表达sirt1增强肿瘤细胞对缺氧的耐受力、细胞凋亡减少。鉴于p5

关键词：结直肠癌凋亡 sirt1亚细胞定位 p53

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