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Host-induced gene silencing of multiple pathogenic factors of Sclerotinia sclerotiorum confers resistance to Sclerotinia rot in Brassica napus

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The Crop Journal 2022年第3期10卷 661-671页

作者： Jian Wu Shengliang Yin Li Lin Dongxiao Liu Sichao Ren Wenjing Zhang Wencheng Meng Peipei Chen Qinfu Sun Yujie Fang Cunxu Wei Youping Wang Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education Yangzhou UniversityYangzhouChina Jiangsu Key Laboratory of Crop Genomics and Molecular Breeding Yangzhou UniversityYangzhouChina

Sclerotinia sclerotiorum is generally considered one of the most economically damaging pathogens in oilseed rape(Brassica napus).Breeding for Sclerotinia resistance is challenging,as no immune germplasm available in B.napus.It is desirable to develop new breeding strategies.In the present study,hostinduced gene silencing(HIGS),developed based on RNA interference(RNAi),was applied to protect B.napus from S.sclerotiorum infection.Three pathogenicity genes,the endo-polygalacturonase gene(Ss PG1),cellobiohydrolase gene(Ss CBH),and oxaloacetate acetylhydrolase gene(Ss OAH1),were chosen as HIGS targets.Co-incubation of synthesized double-stranded RNAs(ds RNAs)with S.sclerotiorum in liquid medium significantly reduced the transcript levels of the target genes.Application to plant surfaces of ds RNA targeting the three genes conferred effective protection against S.sclerotiorum.Stable transgenic B.napus plants expressing small interfering RNAs with sequence identity to Ss PG1,Ss CBH,and Ss OAH1 were generated.HIGS transgenic B.napus prevented the expression of S.sclerotiorum target genes,slowed pathogenicity-factor accumulation,impeded fungal growth,and suppressed appressorium formation,thereby conferring resistance to S.sclerotiorum.Simultaneous silencing of Ss PG1,Ss CBH,and Ss OAH1 by stable expression of a chimeric hairpin RNAi construct in B.napus led to enhanced protection phenotypes(with disease lesion size reduced by 36.8%–43.7%).We conclude that HIGS of pathogenic-factor genes of S.sclerotiorum is a promising strategy for controlling Sclerotinia rot in oilseed rape.

关键词： Sclerotinia sclerotiorum Brassica napus sigs HIGS RNAi

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亚抑菌浓度苯唑西林对OS-MRSA生物膜形成能力的影响及调控机制

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亚抑菌浓度苯唑西林对OS-MRSA生物膜形成能力的影响及调控机制

作者：刘柔杉内蒙古医科大学

学位级别：硕士

目的:分析内蒙古地区住院病人分离苯唑西林敏感甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(OS-MRSA)临床株耐药性及分子流行病学特征,探究亚抑菌浓度苯唑西林对OS-MRSA生物膜形成能力的影响效应及分子机制。方法:1.采用微量肉汤稀释法筛选苯唑西林敏... 详细信息

目的:分析内蒙古地区住院病人分离苯唑西林敏感甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(OS-MRSA)临床株耐药性及分子流行病学特征,探究亚抑菌浓度苯唑西林对OS-MRSA生物膜形成能力的影响效应及分子机制。方法:1.采用微量肉汤稀释法筛选苯唑西林敏感金黄色葡萄球菌,采用PCR方法检测菌株携带mec A和mec C基因情况,确认OS-MRSA株。2.采用自动化仪器法检测OS-MRSA株对常用抗菌药物耐药性;采用菌群分析方法(PAP)检测OS-MRSA株对苯唑西林异质性耐药特征;3.采用MLST、SCCmec分型、spa分型及PFGE分型方法对OS-MRSA株进行分子分型,筛选优势基因型;4.采用乳胶凝集实验检测OS-MRSA株PBP2a蛋白表达量;5.采用PCR方法检测OS-MRSA株毒力基因(sea,seb,sec,sed,see,tsst-1,pvl,hla,hlb,hld,mp HLG1,mp HLG2,eta,etb,ica A,ica B,ica C,ica D,clf A,clf B,fnbp A,fnbp B,bap)携带情况。6.采用结晶紫染色方法检测OS-MRSA株生物膜形成能力及1/2MIC亚抑菌浓度苯唑西林对其影响效应;采用PIA、e DNA及蛋白降解实验,观察OS-MRSA株生物膜中PIA、e DNA及蛋白含量变化与其生物膜形成能力之间的相关性;7.采用实时荧光定量PCR方法检测苯唑西林暴露对OS-200株生物膜形成相关调控基因(ica A、ica B、ica C、ica D、sig B、sig S)m RNA相对表达量的影响。8.采用基因敲除技术构建sig S基因缺失OS-200株;采用秀丽隐杆线虫感染模型观察sig S基因敲除前后,OS-200株毒力变化特征;采用结晶紫染色方法,比较sig S基因敲除前后,OS-200株生物膜形成能力变化特征及与sig S基因之间的相关性。结果:1.研究期间共检出21株OS-MRSA株(1.4%,21/1500),均为mec A基因阳性,而mec C基因阴性。90.48%(19/21)菌株对头孢西丁和苯唑西林均敏感,9.52%(2/21)菌株对头孢西丁耐药;2.21株OS-MRSA菌株对苯唑西林均呈现异质性耐药特征,苯唑西林高水平耐药亚群检出频率介于10～10之间。3.21株OS-MRSA的MLST和spa分型呈多样化趋势,ST22-t309,ST398-t051均占14.29%(2/21)。ST398为优势基因型(19.05%,4/21)。52.38%(11/21)菌株为SCCmec IV型,检出1株(4.76%,1/21)SCCmec I型菌株(OS-678)。4.38.1%(8/21)OS-MRSA菌株PBP2a乳胶凝集试验呈阳性。5.毒力基因(hla,hld,ica A,ica B,ica C,ica D,clf A和clf B)携带率分别为90.48%(19/21)、90.48%(19/21)、100%(21/21)、95.24%(20/21)、90.48%(19/21)、100%(21/21)、90.48%(19/21)和95.24%(20/21)。6.OS-MRSA株呈现较强的生物膜形成能力,3株(14.29%)为强产膜株,13株(61.90%)为中产膜株,5株(23.81%)为弱产膜株。与对照组相比,亚抑菌浓度苯唑西林(1/2MIC)作用下,21株OS-MRSA株生物膜形成能力均增强。7.亚抑菌浓度苯唑西林(1/2MIC)作用24小时后,OS-200株生物膜形成及调控相关基因(ica A、ica D、ica B、ica C、sig B、Sar A)m RNA相对表达量分别升高14.26、13.27、133.82、11.67、173.40、43.97倍(p0.05)。结论:1.本研究所得OS-MRSA株多数对头孢西丁敏感,且均呈现苯唑西林异质性耐药特征。实验室常规耐药表型检测方法容易将OS-MRSA株错误鉴定为MSSA,应联合mec A及mec C基因检测方法和耐药表型检测技术,以降低OS-MRSA漏检率。2.亚抑菌浓度苯唑西林可显著促进OS-MRSA生物膜形成,这种促进效应主要与ica操纵子表达上调进而增加PIA合成有关。3.亚抑菌浓度苯唑西林主要通过活化sig B及下游Sar A调控基因,促进OS-MRSA ica ADBC基因表达;sig S基因在此调控过程中无明显作用。

关键词： OS-MRSA 异质性耐药生物膜调控机制 sigs

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基于跨界RNAi防治水稻稻曲病的研究

基于跨界RNAi防治水稻稻曲病的研究

中国植物病理学会2023年学术年会

作者：章宇婕阴伟晓罗朝喜华中农业大学植物科学技术学院

由Ustilaginoidea virens引起的水稻稻曲病已成为全球水稻种植区最具破坏性的病害。目前,对于稻曲病的防治主要是采用化学药剂,抗稻曲病品种选育也未有突破性进展。近来研究表明,体外合成的dsRNA直接喷施于植物表面可以显著提高植物的... 详细信息

由Ustilaginoidea virens引起的水稻稻曲病已成为全球水稻种植区最具破坏性的病害。目前,对于稻曲病的防治主要是采用化学药剂,抗稻曲病品种选育也未有突破性进展。近来研究表明,体外合成的dsRNA直接喷施于植物表面可以显著提高植物的抗病性,即喷雾诱导基因沉默(Spray-induced gene silencing,sigs)。本课题组将相关病原菌靶基因的双链RNA (doublestranded RNA,dsRNA)作用于稻曲病菌孢子,测定靶基因的表达量,以探究稻曲病菌对外源RNA的吸收能力。为了提高dsRNA的吸收效率以及dsRNA在环境中的稳定性,筛选纳米材料负载RNA。本研究采用单凝聚法制备CS-dsRNA和离子交联法制备CS-TPP-dsRNA,对比二者进入孢子的效率,为后续利用纳米材料在RNAi防治水稻稻曲病的应用奠定了基础。除此之外,针对选取的靶基因开发了利用HIGS (Host-induced gene silencing)技术的新型抗病品种。该研究有利于进一步建立和完善绿色水稻稻曲病的防控技术体系。

关键词：水稻稻曲病 sigs 双链RNA HIGS 病害防治

来源： cnki会议评论

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“RNAi农药”防治植物病毒病的研究进展

中国植保导刊 2020年第1期40卷 29-34,54页

作者：解昆仑郭珍古勤生中国农业科学院郑州果树研究所河南郑州450009

病毒病一直是农作物重要病害,目前为止还没有一种有效的方法能够防治植物病毒病。"RNAi农药"是指体外制备的能够诱发病原菌和昆虫某基因沉默从而达到防治目的的dsRNA或者siRNA产品。本文总结了喷施诱导的基因沉默(Spray-induced gene si... 详细信息

病毒病一直是农作物重要病害,目前为止还没有一种有效的方法能够防治植物病毒病。"RNAi农药"是指体外制备的能够诱发病原菌和昆虫某基因沉默从而达到防治目的的dsRNA或者siRNA产品。本文总结了喷施诱导的基因沉默(Spray-induced gene silencing,sigs)过程,"RNAi农药"的研究历程及其在防治植物病毒病中的应用进展,分析了存在的问题并对其未来发展进行了展望。

关键词： RNAi dsRNA sigs 植物病毒病

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禾谷镰刀菌药敏性相关基因及其调控研究

禾谷镰刀菌药敏性相关基因及其调控研究

作者：效雪梅南京农业大学

学位级别：硕士

禾谷镰刀菌不仅引起麦类赤霉病造成减产,而且还产生毒素污染谷粒危害人畜健康。因此,研究安全、高效可持续防治麦类赤霉病的理论与技术是摆在我们面前的重要任务。长期以来,国内外的麦类赤霉病防控主要依靠化学防治,我国主要使用的是苯... 详细信息

禾谷镰刀菌不仅引起麦类赤霉病造成减产,而且还产生毒素污染谷粒危害人畜健康。因此,研究安全、高效可持续防治麦类赤霉病的理论与技术是摆在我们面前的重要任务。长期以来,国内外的麦类赤霉病防控主要依靠化学防治,我国主要使用的是苯并咪唑类多菌灵杀菌剂。然而,随着用药时间的延长与用药剂量的增大,赤霉病菌在自然界已形成了苯并咪唑类杀菌剂抗药性群体,以致一些地区化学防治失败。研究表明,镰刀菌的多菌灵受体β2-微管蛋白发生点突变是导致病原菌产生抗药性的原因。β2-微管蛋白是镰刀菌中结构与功能调控蛋白,与多种蛋白存在调控或被调控的关系。本文研究了 FgASK1与β2-微管蛋白的互作及对微管蛋白抑制剂的敏感性调控及机制,初步探索了核酸农药Myo5-8 dsRNA防治赤霉病在病原真菌和寄主植物体内的行为,为揭示杀菌剂的毒理学机制及其高效应用技术研发提供科学依据。我们首先利用酵母互作蛋白库(Uniprot)筛选到FgASK1蛋白,已知这是一种在细胞分裂过程中对于染色体分离具有重要作用的DASH复合体蛋白亚基。本研究发现该蛋白与Fgβ2-tub具有相互作用,FgASK1蛋白缺失会引起禾谷镰刀菌野生型菌株和Fgβ2-tub抗药性点突变体对微管蛋白抑制剂多菌灵敏感性的不同变化,而对其他类型的杀菌剂敏感性不变。野生型菌株、Y50C-2和E198K多菌灵抗性突变体缺失FgASK1后,对多菌灵的敏感性分别增加了 32.2%、42.5%和40.8%,而F167Y缺失FgASK1则对多菌灵的抗药性水平不变。说明FgASK1可能通过与Fgβ2-tub互作发挥功能,互作位点与多菌灵药剂结合位点相关,Fgβ2-tub的50位和198位可能是苯并咪唑类药剂和FgASK1共同结合的位点,167位是药剂的主要结合位点而与FgASK1结合作用较低。体外Fgβ2-tub与FgASK1蛋白互作实验发现,与野生型菌株相比,Y50C-2和E198K点突变体中Fgβ2-tub蛋白与FgASK1蛋白互作强度分别降低了 44.2%和48.9%,而167位点突变的Fgβ2-tub与FgASK1互作强度仅降低了 2.3%,证实了我们的猜想。采用双荧光标记的蛋白细胞共定位观察发现,FgASK1蛋白与Fgβ2-tub互作形成复合体的时间很短,大约2s后发生分离。另外,实验发现FgASK1蛋白对禾谷镰刀菌的有性生殖产生一定影响,但Fgβ2-tub不同点突变体间无差异,表明FgASK1对有性生殖的调控受Fgβ2-tub点突变影响较小;FgASK1蛋白还调控禾谷镰刀菌的生长、无性生殖和孢子形态,而且Y50C-2和E198K点突变菌株与FgASK1突变体呈现相似表型,说明FgASK1对菌株生长、无性生殖和孢子形态的调节可能是通过Fgβ2-tub实现的,且二者结合的位点位于Fgβ2-tub的50和198位。Myo5-8 dsRNA是本实验室最近针对亚洲镰刀菌重要杀菌剂靶标肌球蛋白编码基因,以RNA干扰原理研发的一种新型核酸杀菌剂,通过喷雾诱导基因沉默(Spray-induced gene silencing,sigs)发挥抗菌作用,但sigs的机制尚不清楚。本研究发现Myo5-8 dsRNA喷施于小麦叶面后,可通过伤口更有效地被叶片吸收,并进入维管束运输实现再分布。进入植物细胞中的Myo5-8 dsRNA可以通过小麦叶片组织细胞的加工及siRNA级联放大机制转化为大量的siRNA。然而,渗透进入镰刀菌细胞的Myo5-8 dsRNA,则没有诱导RNAi级联放大效应,真菌细胞内的siRNA均是由外源dsRNA切割产生的初级siRNA,相关放大效应的基因表达也未受诱导,导致dsRNA在镰刀菌细胞中的浓度低、持效期短。该研究初步揭示了 Myo5-8 dsRNA在病原真菌和植物体内的行为,为Myo5-8 dsRNA的进一步优化及应用技术研发提供了理论依据。

关键词：小麦赤霉病禾谷镰刀菌 FgASK1 Fgβ2-tub Myo5-8 dsRNA sigs

抑制稻瘟病菌的人工小分子RNA的筛选及机制研究

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抑制稻瘟病菌的人工小分子RNA的筛选及机制研究

作者：丁绍晨南京农业大学

学位级别：硕士

稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）对重要的农作物如水稻、大麦、小麦和小米具有致病性,由这种病原体真菌引起的稻瘟病是全世界水稻中最严重的病害之一,严重时可导致水稻减产40%-50%。水稻是我国的重要作物,在全国范围内超过50%的人口以稻... 详细信息

稻瘟病菌（Magnaportheoryzae）对重要的农作物如水稻、大麦、小麦和小米具有致病性,由这种病原体真菌引起的稻瘟病是全世界水稻中最严重的病害之一,严重时可导致水稻减产40%-50%。水稻是我国的重要作物,在全国范围内超过50%的人口以稻米为生,所以研究水稻有着巨大的经济意义以及研究意义。目前控制稻瘟病主要依赖使用农药和培育水稻抗病品种等传统防治手段。农药防治稻瘟病具有诸多弊端,此外稻瘟病菌容易发生变异,产生新的致病小种,导致水稻抗病品种生产3-5年后抗病性大幅减弱。稻瘟病菌的致病机理是研究分子与病原体相互作用的出色研究对象,为了更好地防治稻瘟病,需要从分子水平上研究防治稻瘟病的策略。RNAi（RN A interference）是真核生物中调节基因表达的重要机制,在植物与微生物的互作中起到重要的作用,所以,RNAi是控制由真菌病原体引起的病害的有效策略。我们设想利用人工合成的特定小分子RNA去沉默稻瘟病菌必需基因,从而抑制其致病性。喷雾诱导的基因沉默（sigs（Spray-induced gene silencing））是指利用人工合成的小分子RNA靶向真菌病原体必需基因抑制真菌致病性来保护宿主植物。MAPK（Mitogen-activated protein kinase）途径在稻瘟病菌附着胞形成过程中非常重要,Pth11作为MAPK途径的上游基因,参与多种生物过程,是稻瘟病菌形成附着胞所必需的。细胞色素b是一种膜蛋白,由位于线粒体基因组中的细胞色素b（Cyt-B）基因编码,对该基因的抑制对病原菌是致命的。最新研究表明,在病原物侵染植物时,体外施加小分子RNA会进入病原物体内并调控相关基因表达,从而抑制其致病性。受此启发,我们利用小分子RNA跨界沉默靶标基因的机制,设计了靶向稻瘟病菌致病相关基因Pth11和生长必需基因Cyt-B的小分子RNA。然后利用sigs的RNAi的分子作用机制,体外喷洒人工小分子RNA,从而达到抑制稻瘟病菌的目的。实验结果表明,人工小分子RNA不仅沉默稻瘟病菌中的靶标基因,还在短时间内抑制稻瘟病菌附着胞的形成。在大麦和水稻的离体实验中,人工小分子RNA也有效控制了稻瘟病菌的发病程度。这一结论不仅证明了体外施加人工小分子RNA可以有效地沉默稻瘟病菌致病基因的表达,也为以后的稻瘟病菌防治提供了新的思路。

关键词：水稻稻瘟病人工小分子RNA RNAi sigs

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基于跨界RNAi防治水稻纹枯病的研究

基于跨界RNAi防治水稻纹枯病的研究

Evolution of Disease Defense Genes and Their Regulators in Plants

中国植物病理学会2021年学术年会

作者：颜沁兰驰牛冬冬南京农业大学植物病理系

水稻纹枯病是水稻生产上的重要病害之一,由立枯丝核菌侵染引起,该病害主要发生在水稻的叶鞘和叶片。近年来,水稻纹枯病在我国主要稻区危害日趋严重。基于跨界RNAi通过体外合成靶向病原菌致病基因的双链RNA （double-stranded RNA,dsRNA... 详细信息

水稻纹枯病是水稻生产上的重要病害之一,由立枯丝核菌侵染引起,该病害主要发生在水稻的叶鞘和叶片。近年来,水稻纹枯病在我国主要稻区危害日趋严重。基于跨界RNAi通过体外合成靶向病原菌致病基因的双链RNA （double-stranded RNA,dsRNA）,将其喷洒在植物表面,能够阻碍病害发生,即喷雾诱导的基因沉默（sigs,spray-induced gene silencing）,是植物病害绿色防控的新策略。本课题组通过检测多种致病和非致病真菌以及卵菌病原体的dsRNA吸收效率,发现立枯丝核菌、核盘菌和灰葡萄孢菌等病原菌对dsRNA能够有效吸收,而炭疽病菌不吸收,有益真菌绿色木霉对dsRNA的吸收能力较弱;对于致病疫霉—卵菌属植物病原体,dsRNA的吸收较低,并且在不同的细胞类型和发育阶段都有所不同;通过跨界RNAi防病效果的实验,发现sigs对吸收dsRNA效率高的病原菌具有较好的防治效果,而在具有低dsRNA吸收效率的病原菌中施用并不抑制侵染。研究结果表明不同的真核微生物物种和细胞类型,它们对于dsRNA的吸收效率也各不相同,sigs的防治效果依赖于病原菌对dsRNA的吸收效率,所以RNAi防治水稻纹枯病等病害具有很好的应用前景。因此,为了提高dsRNA的吸收效率及dsRNA在自然环境中的稳定性,笔者筛选了壳聚糖、鱼精蛋白、碳量子点等纳米材料对dsRNA的稳定性及吸收效率的影响,通过静电作用将纳米材料与dsRNA负载结合,发现壳聚糖、聚乙烯亚胺等纳米材料对dsRNA的负载量较高,壳聚糖复合物等纳米材料可以提高纹枯病菌对dsRNA的吸收效率,研究结果为后续利用纳米材料在RNAi防治水稻纹枯病上的应用奠定了基础,有利于进一步建立和完善绿色水稻纹枯病的防控技术体系。

关键词：水稻纹枯病菌 sigs 双链RNA 纳米材料病害防治

来源： cnki会议评论

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Evolution of Disease Defense Genes and Their Regulators in P...

中国生物工程学会第十三届学术年会暨2019年全国生物技...

作者： Rongzhi Zhang Fengya Zheng Shugen Wei Shujuan Zhang Genying Li Peijian Cao Shancen Zhao Institute of Crop Science Shandong Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Wheat Biology & Genetic Improvement on North Yellow & Huai River Valley Ministry of Agriculture National Engineering Laboratory for Wheat & Maize BGI Institute of Applied Agriculture BGI-Agro Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants China Tobacco Gene Research Center Zhengzhou Tobacco Research Institute of CNTC

Biotic stresses do damage to the growth and development of plants, and yield losses for some crops. Confronted with microbial infections, plants have evolved multiple defense mechanisms, which play important roles in the never-ending molecular arms race of plant–pathogen interactions. The complicated defense systems include pathogen-associated molecular patterns(PAMP) triggered immunity(PTI), effector triggered immunity(ETI), and the exosome-mediated cross-kingdom RNA interference(CKRI) system. Furthermore, plants have evolved a classical regulation system mediated by miRNAs to regulate these defense genes. Most of the genes/small RNAs or their regulators that involve in the defense pathways can have very rapid evolutionary rates in the longitudinal and horizontal co-evolution with pathogens. According to these internal defense mechanisms, some strategies such as molecular switch for the disease resistance genes, host-induced gene silencing(HIGS), and the new generation of RNA-based fungicides, have been developed to control multiple plant diseases. These broadly applicable new strategies by transgene or spraying ds/sRNA may lead to reduced application of pesticides and improved crop yield.

关键词： disease resistance gene miRNA regulation CKRI ETI PTI HIGS sigs

来源： cnki会议评论

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美国情报学会专业组简介

情报理论与实践 1992年第5期15卷 44-46页

作者：阎建华杜元清航天情报所

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