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番茄滞绿突变体果实后熟及sgr1突变分析

番茄滞绿突变体果实后熟及SGR1突变分析

作者：邓洁华南农业大学

学位级别：硕士

番茄(Solanum lycopersicum)是典型的呼吸跃变型果实,成熟的过程中叶绿体结构解体,叶绿素快速降解;类胡萝卜素尤其是番茄红素大量合成并积累在有色体中,果实呈现红、橙或黄色。目前,高等植物叶绿素降解和类胡萝卜素合成途径已经研究得... 详细信息

番茄(Solanum lycopersicum)是典型的呼吸跃变型果实,成熟的过程中叶绿体结构解体,叶绿素快速降解;类胡萝卜素尤其是番茄红素大量合成并积累在有色体中,果实呈现红、橙或黄色。目前,高等植物叶绿素降解和类胡萝卜素合成途径已经研究得较为透彻,但在果实后熟色泽变化过程中,两条代谢途径的调控以及之间的相互关系研究甚少。本文利用叶绿素降解关键基因——滞绿基因1(STAY GREEN 1,sgr1)发生不同自然突变的三种滞绿番茄果实为材料,研究突变体果实的后熟特性、叶绿素降解以及类胡萝卜素的合成,分析三种突变体sgr1的突变模式的功能,以探讨sgr1突变对果实后熟、叶绿素降解以及类胡萝卜素的合成的影响。主要研究结果如下:1、利用外源乙烯对野生型AC番茄和三种自然后熟突变体果实进行催熟。乙烯处理9 d后,AC果实完全变红,eg果实仍保持绿色,含有大量叶绿素且不积累番茄红素;gf1含有大量叶绿素并积累大量番茄红素导致果实呈褐色;gf2含有部分叶绿素且积累大量番茄红素呈褐色。三种sgr1突变体均可以正常软化,为C型滞绿。2、野生型AC番茄的sgr1基因编码区包括818 bp碱基,编码含271个氨基酸的蛋白。eg的sgr1转录本在460位碱基后,由于可变剪切多了32 bp碱基内含子片段,其中含有终止密码子TAA,导致其编码的蛋白提前终止,只有156个氨基酸。gf1则因为271位碱基C替换为T,导致出现终止密码子TAA,使其编码的蛋白提前终止,为90个氨基酸。gf2的sgr1为429位出现碱基A替换为T,导致第143位精氨酸突变为丝氨酸,共271个氨基酸。由此推断sgr1的C端对其功能具有重要作用,且gf2中被替换的精氨酸对sgr1功能具有重要影响。3、与野生型AC相比,突变体果实后熟过程中,三种sgr1突变体的sgr1和PPH等叶绿素降解相关基因表达较低。eg突变体的类胡萝卜素合成相关基因PSY1和GGPS2等基因表达量明显低于野生型;gf1的PSY1、ZDS等基因表达量在6 d时明显高于野生型;gf2的PSY1、PDS、ZDS等在3 d已出现明显上调趋势,比野生型提前启动上调。4、突变体叶片衰老过程中叶绿素降解相关基因的表达情况为:CLH1、CLH3、CLH4表达量高于野生型,推测sgr1发生突变失去功能并且转录受到抑制,为了减少伤害,启动了原本不参与叶片衰老的CLH降解叶绿素。5、成功构建UBQ10-sgr1-GFP载体并转入本氏烟草的叶片中,利用荧光共聚焦技术发现,转入AC-sgr1-GFP与gf2-sgr1-GFP载体的叶片中能够观察到绿色荧光,而转化eg与gf1的sgr1过表达载体的烟草叶片因突变sgr1翻译提前终止而不能观察到绿色荧光。转化AC的sgr1过表达载体的烟草叶片在48 h时衰老变黄,转化突变体sgr1过表达载体的烟草叶片与转化野生型sgr1的叶片相比则明显滞绿。通过HPLC检测脱镁螯合酶活力发现,转化野生型sgr1过表达载体的烟草叶片检测到有叶绿素降解产物生成,而在转化三种突变体sgr1过表达载体的烟草叶片未检测到。推测sgr1的C端非常重要,翻译提前终止会严重影响其功能,gf2则发生重要氨基酸突变,导致活性中心或构型发生变化影响了sgr1功能。综上所述,三种自然滞绿突变体为C型滞绿,是研究番茄色素代谢途径及调控的好材料。eg与gf1的sgr1由于缺少C端部分导致功能丧失,而gf2则是因为精氨酸突变为丝氨酸导致功能缺失。叶片中sgr1突变后,为了减少毒害,叶片启动原本沉默的CLH基因降解叶绿素。

关键词：番茄 sgr1 滞绿突变体基因功能分析农杆菌注射

Arabidopsis STAY-GREEN2 Is a Negative Regulator of Chlorophyll Degradation during Leaf Senescence

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Molecular Plant 2014年第8期7卷 1288-1302页

作者： Yasuhito Sakuraba So-Yon Park Ye-Sol Kim Seung-Hyun Wang Soo-Cheul Yoo Stefan Hortensteiner Nam-Chon Paek Department of Plant Science Plant Genomics and Breeding Institute Research Institute of Agriculture and Life Sciences Seoul NationalUniversity Seoul 151-921 Korea Present address: Department of Plant Pathology Physiology and Weed Science Virginia Tech Blacksburg VA 24061 USA Present address: Advanced Radiation Technology Institute Korea Atomic Energy Research Institute Jeongeup 580-185 Korea Department of Plant & Environmental Science Hankyong National University Ansung 456-749 Korea Institute of Plant Biology University of Zurich CH-8008 Zurich Switzerland

Chlorophyll （Chl） degradation causes leaf yellowing during senescence or under stress conditions. For Chl breakdown, STAY-GREEN1 （sgr1） interacts with Chl catabolic enzymes （CCEs） and light-harvesting complex II （LHCII） at the thylakoid membrane, possibly to allow metabolic channeling of potentially phototoxic Chl breakdown intermediates. Among these Chl catabolic components, sgr1 acts as a key regulator of leaf yellowing. In addition to sgr1 （At4g22920）, the Arabidopsis thaliana genome contains an additional homolog, sgr2 （At4g11910）, whose biological function remains elusive. Under senescence-inducing conditions, sgr2 expression is highly up-regulated, similarly to sgr1 expression. Here we show that sgr2 function counteracts sgr1 activity in leaf Chl degradation; sgr2-overexpressing plants stayed green and the sgr2-1 knockout mutant exhibited early leaf yellowing under age-, dark-, and stress-induced senescence conditions. Like sgr1, sgr2 interacted with LHCII but, in contrast to sgr1, sgr2 interactions with CCEs were very limited. Furthermore, sgr1 and sgr2 formed homo- or heterodimers, strongly suggesting a role for sgr2 in negatively regulat- ing Chl degradation by possibly interfering with the proposed CCE-recruiting function of sgr1. Our data indicate an antagonistic evolution of the functions of sgr1 and sgr2 in Arabidopsis to balance Chl catabolism in chloroplasts with the dismantling and remobilizing of other cellular components in senescing leaf cells.

关键词： Arabidopsis thaliana stay-green sgr1 sgr2 chlorophyll degradation leaf senescence abiotic stress.

SlCLH1/CLH4在番茄果实后熟色泽转变中的功能研究

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SlCLH1/CLH4在番茄果实后熟色泽转变中的功能研究

作者：黎樱嫚华南农业大学

学位级别：硕士

叶绿素降解是叶片衰老和果实成熟的标志性事件,叶片衰老时叶绿素的降解过程已经研究的较为清楚,但在果实后熟过程中叶绿素的降解还存在较多不清晰之处。本论文首先通过番茄Solanum lycopersicum,cv.‘Ailsa Craig’(AC)、滞绿突变体gree... 详细信息

叶绿素降解是叶片衰老和果实成熟的标志性事件,叶片衰老时叶绿素的降解过程已经研究的较为清楚,但在果实后熟过程中叶绿素的降解还存在较多不清晰之处。本论文首先通过番茄Solanum lycopersicum,cv.‘Ailsa Craig’(AC)、滞绿突变体greenflesh 1(gf1)和green-flesh 2(gf2)植株叶片衰老和果实后熟过程中叶绿素降解相关基因的表达规律,发现叶片与果实中叶绿素代谢途径的异同。随后,运用CRISPR/Cas9基因编辑技术分别或共同敲除CLH1、CLH4和sgr1基因,研究叶绿素酶(Chlorophyllase,CLH)在果实后熟过程中的作用。主要研究结果如下:1、两种sgr1突变体番茄gf1和gf2叶片黑暗培养下滞绿,而果实后熟过程却能降解大部分叶绿素。叶片衰老过程,四个叶绿素酶基因表达量下降;gf2叶片sgr1和PPH几乎不表达。在AC、gf1和gf2果实后熟过程,CLH1和CLH4在早期(3 d)有高表达。CLH1蛋白表达和基因表达呈相似规律,在果实后熟早期蛋白水平较高。sgr1和PPH则是在果实后熟的晚期(6 d或9 d)有表达高峰。gf1和gf2番茄红素合成相关基因GGPS2、PSY1的表达量显著高于AC。2、分别构建了CLH1、CLH4和sgr1的单基因、双基因和三基因编辑的CRISPR/Cas9载体,通过遗传转化番茄*** cv.‘Micro Tom’,获得了T1代clh1、clh4、clh1 clh4和sgr1 clh1 clh4等单基因、双基因和三基因突变纯合体。3、植株自然衰老过程,Micro Tom(野生型)、clh1、clh4和clh1 clh4叶片叶绿素正常降解,而sgr1 clh1 clh4突变体叶片滞绿。与野生型果实相比,clh1、clh4、clh1clh4和sgr1 clh1 clh4果实均表现后熟过程褪绿延迟,番茄红素积累变慢,且含量降低。4、与野生型番茄相比,clh1、clh4和clh1 clh4突变体果实中,sgr1、PPH、PAO提前上调表达;而番茄红素合成相关基因GGPS2、PSY1、PDS、ZDS延迟上调,总体表达量低于野生型。5、原核表达重组CLH1能于体外降解叶绿素,生成脱植基叶绿素。CLH4在番茄果实中的转录发生可变剪切,缺失了502 bp的编码区是CLH4主要的转录本;且CLH4可变剪切发生在C端957碱基处;原核表达重组CLH4的三种转录本,体外未能检测到叶绿素酶的活性。综上所述,番茄果实存在独立于sgr-PPH的其他叶绿素降解酶,叶绿素酶可能参与果实后熟过程叶绿素的降解,从而影响番茄红素的积累。

关键词：番茄果实叶绿素降解番茄红素积累叶绿素酶 sgr1 CRISPR/Cas9

BSA与RNA-seq探讨番茄突变体eg果实后熟着色缺陷的分子机制

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BSA与RNA-seq探讨番茄突变体eg果实后熟着色缺陷的分子机制

作者：陈淑祯华南农业大学

学位级别：硕士

番茄(Solanum lycopersicum Mill)是呼吸跃变型果实,果实在后熟过程中叶绿素快速降解,番茄红素大量合成,其果皮颜色由绿色转变为红色。目前,番茄果实中的叶绿素降解途径和番茄红素合成途径的研究较为清晰,但叶绿素降解和番茄红素合成的... 详细信息

番茄(Solanum lycopersicum Mill)是呼吸跃变型果实,果实在后熟过程中叶绿素快速降解,番茄红素大量合成,其果皮颜色由绿色转变为红色。目前,番茄果实中的叶绿素降解途径和番茄红素合成途径的研究较为清晰,但叶绿素降解和番茄红素合成的调控机制尚不清楚。本文利用一种能正常褪绿变红的番茄Solanum lycopersicum,*** Craig(AC)果实和一种不能褪绿变红的自然突变体番茄ever green(eg)果实为材料,通过BSA与RNA-seq探讨番茄果实后熟着色缺陷的分子机制。获得的主要研究结果如下:1.利用乙烯对绿熟期的野生型AC与突变体eg番茄果实进行催熟。乙烯处理后第9 d,果实硬度与可溶性固形物含量测定显示,AC和eg果实能正常成熟。在后熟过程中,AC果实的叶绿素降解,番茄红素合成,果实变红,叶绿体转变为有色体;而eg果实的叶绿素降解与番茄红素合成都受阻,没有形成有色体。由此可知,突变体eg是C型非功能滞绿突变体。2.以野生型AC为父本、突变体eg为母本杂交,构建F2代分离群体。F2代群体中出现红果、红带绿果、黄果和绿果四种颜色果实表型,其分离比为9:3:3:1。初步推断,突变体eg番茄为双基因隐性突变体。红带绿果和绿果的叶绿素降解受阻,红果和黄果的叶绿素正常降解。此外,红果和红带绿果的番茄红素合成途径正常,叶绿体能转变为有色体;黄果和绿果番茄红素合成途径受阻,没有形成有色体。3.通过Bulked Segregant Analysis(BSA)测序发现,eg在3号染色体和8号染色体的突变与果实色泽极显著相关,表明番茄突变体eg是双位点突变,与F2代群体的性状分离比为9:3:3:1相符。4.通过分析区间内的候选基因,发现8号染色体区间内存在一个与叶绿素降解相关的基因——滞绿基因1(STAY GREEN 1,sgr1),此基因有一个SNP突变位点,在3号内含子5’端第二个碱基由T突变成C,导致3号内含子的剪切发生改变。结合RNA-seq测序结果发现,sgr1基因在3号和4号外显子之间插入了含终止密码子TAA的32 bp内含子片段,导致蛋白翻译提前终止。使用F2代群体中50株红带绿果和35株绿果植株对sgr1基因的SNP位点进行验证,85个隐性植株在该位点均发生T突变成C,证明sgr1是8号染色体区间内的目的基因,控制eg番茄果实叶绿素降解。5.在3号染色体上成功开发了5对具有多态性的In Del标记,对3号染色体候选基因进行区间定位,最后把候选区间缩小到3号染色体前8 Mb以内。6.通过RNA-seq分析果实后熟过程中基因的差异变化,发现与AC果实相比,eg果实后熟过程中Solyc01g088090(PPH)、Solyc08g080090(sgr1)、Solyc03g031860(PSY1)、Solyc02g081330(PSY2)、Solyc06g074240(CYC-B)、Solyc02g081170(CHRC)、Solyc03g093830(OR)、Solyc03g082420(HSP21-1)和Solyc05g014280(HSP21-2)基因的表达水平较低。此外,AC和eg番茄果实的捕光色素复合体(LHCI和LHCII)与光系统(PSI和PSII)相关基因呈现下调趋势,且在AC果实中下调更为显著。综上所述,番茄突变体eg为双基因隐性突变体,位于8号染色体上的sgr1基因突变导致eg果实后熟过程中叶绿素降解受阻,位于3号染色体上的基因突变可能导致有色体形成受阻。推测由于储存番茄红素的结构——有色体的形成受阻导致eg果实后熟中不能合成番茄红素。

关键词：番茄突变体eg 叶绿素降解番茄红素合成有色体 sgr1