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sfn-RAB7通路调控EMT抑制鼻咽癌细胞迁移侵袭的研究

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SFN-RAB7通路调控EMT抑制鼻咽癌细胞迁移侵袭的研究

作者：杨明秀南华大学

学位级别：硕士

【目的】本研究旨在探讨sfn-RAB7通路在调控上皮间质转化(EMT)中的作用,及其与鼻咽癌(NPC)迁移侵袭的关系,为临床上NPC的靶向治疗提供理论依据和实验基础。【方法】1.采用Western Blot检测NPC细胞系5-8F和6-10B中sfn与RAB7的表达情况。2... 详细信息

【目的】本研究旨在探讨sfn-RAB7通路在调控上皮间质转化(EMT)中的作用,及其与鼻咽癌(NPC)迁移侵袭的关系,为临床上NPC的靶向治疗提供理论依据和实验基础。【方法】1.采用Western Blot检测NPC细胞系5-8F和6-10B中sfn与RAB7的表达情况。2.利用ZDOCK2.3.2在线网站分析sfn与RAB7之间的结合关系。3.利用p CDH-CMV-MCS-EF1a-GFP载体和Tet-p LKO-puro载体构建sfn过表达、RAB7过表达以及sfn干扰载体,经293T细胞包装成慢病毒,再将慢病毒液感染NPC细胞,获得稳定sfn过表达、RAB7过表达以及sfn干扰重组细胞系,研究NPC重组细胞系迁移侵袭能力变化及其与EMT的关系。4.将si RAB7瞬时转染于NPC细胞,研究干扰RAB7对NPC细胞迁移侵袭能力影响及其与EMT的关系。5.采用Western Blot检测重组NPC细胞系中sfn和RAB7的调控关系。6.将RAB7过表达组及对照NC组病毒液分别感染5-8F-NC、5-8F-sfn-OE细胞,建立共转染稳转细胞株并观察共转染重组NPC细胞系的迁移侵袭能力变化及其与EMT的关系。将si RAB7、sinc分别瞬时转染5-8F-scramble、5-8F-sfn-sh RNA细胞株,观察共转染重组NPC细胞系的迁移侵袭能力影响及其与EMT的关系。【结果】1.在sfn低表达的5-8F细胞中,RAB7呈现相对高表达;在sfn高表达的6-10B细胞中呈相对低表达;sfn和RAB7的蛋白相对表达呈现负相关。***蛋白的b链与RAB7蛋白的a链能稳定结合形成三维结构。3.在过表达sfn后,划痕实验结果显示,细胞划痕愈合率较小(Psfn干扰组中表现为与以上相反的结果。4.在过表达RAB7后,划痕实验结果显示,细胞划痕愈合率较大(Psfn过表达时,RAB7表达减少(Psfn表达时,RAB7表达增多(Psfn的表达量无明显变化趋势。说明sfn可下调RAB7表达。6.共转染sfn和RAB7后划痕和Transwell实验结果分别显示,单独敲低RAB7时,细胞迁移愈合率减小(Psfn和同时敲低sfn和RAB7细胞愈合率增大(Psfn和同时过表达sfn和RAB7后,细胞愈合率减小(Psfn和RAB7后Western Blot实验结果显示,单独敲低RAB7后,细胞中Vimentin和N-cadherin表达下调(Psfn和同时敲低sfn和RAB7后,细胞中Vimentin和N-cadherin表达上调(Psfn和同时过表达sfn和RAB7后,细胞中Vimentin和N-cadherin表达下调(Psfn抑制NPC的迁移侵袭,干扰sfn能促进NPC迁移侵袭;过表达RAB7促进NPC的迁移侵袭,干扰RAB7抑制NPC迁移侵袭。***-RAB7之间存在单向负调控作用。3.在NPC细胞中,sfn-RAB7通路通过抑制EMT抑制NPC的迁移侵袭。

关键词：鼻咽癌 sfn RAB7 迁移侵袭

莱菔硫烷（sfn）通过在LPS激活的BV-2细胞中下调MAPK/NF-κB信号通路以降低小胶质细胞介导的神经元程序性坏死

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莱菔硫烷（SFN）通过在LPS激活的BV-2细胞中下调MAPK/NF-κB信号...

作者：覃偲偲南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景莱菔硫烷(sfn)有很强的抗癌、抗氧化和抗炎作用,但是sfn在小胶质细胞介导的炎症反应中的潜在机制仍不清楚。小胶质细胞属于中枢神经系统的常在免疫细胞。研究表明,炎症反应参与了诸如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森病在内... 详细信息

研究背景莱菔硫烷(sfn)有很强的抗癌、抗氧化和抗炎作用,但是sfn在小胶质细胞介导的炎症反应中的潜在机制仍不清楚。小胶质细胞属于中枢神经系统的常在免疫细胞。研究表明,炎症反应参与了诸如阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和帕金森病在内的神经退行性疾病。脂多糖(LPS)被广泛用于诱导小胶质细胞的免疫反应,包括TNF-α,IL-1β,IL-6,iNOS等细胞因子的过度表达。MAPK和NF-kB信号通路的激活是LPS诱导炎症反应的重要标志物。NF-kB在免疫和炎症反应中起着关键作用,而MAPK激酶(p38,JNK,ERK1/2)是细胞功能的关键调节因子。许多神经疾病与炎症密切相关,当比较不同炎症介质的影响时,TNF-α在诱导神经元损伤起到了重要作用。TNF-α可以通过结合TNF受体诱发凋亡,或在某些情况下诱发程序性坏死,RIP3和MLKL是程序性坏死的关键指标。研究目的本研究旨在探讨在LPS诱导BV-2细胞产生的炎症反应过程中sfn对包括TNF-α,IL-1β，IL-6,iNOS在内的炎症介质及上清培养基中TNF-α,IL-6释放的抑制作用,并且进一步探讨了 sfn在与MAPK/NF-kB信号通路相关的小胶质细胞介导的神经元程序性坏死中的内在机制作用。研究方法1、CCK-8法检测BV-2和神经元的的细胞活性;2、qPCR 检测 TNF-α，IL-1β,IL-6,iNOS 的 RNA 表达;3、ELISA方法检测BV-2细胞上清培养基中的TNF-α，IL-1β,IL-6,iNOS含量;4、免疫荧光法观察神经元的形态变化;5、TUNEL检测神经元的凋亡情况;6、Western blot analysis 检测 TNF-α,IL-1β，IL-6，iNOS 的蛋白表达;p38,JNK，ERK1/2,p65的总蛋白水平和磷酸化水平;Westernblotanalysis检测神经元的 caspase-3,Bax，RIPK3,MLKL 的蛋白水平。研究结果1、CCK8结果提示sfn对BV-2细胞的激活有明显的抑制作用。2、Western blot analysis 和 qPCR 的结果提示,sfn 明显抑制了 TNF-α，IL-1β,IL-6，iNOS的蛋白表达和RNA表达,ELISA结果提示sfn抑制了 BV-2细胞上清中TNF-α,IL-6的释放。3、Western blot analysis 结果提示 sfn,抑制剂 SB203580、U0126、SP600125、PDTC单独或与sfn也明显抑制了 LPS诱导BV-2细胞产生的p38,JNK,ERK1/2,NF-kBp65蛋白的磷酸化。4、Western blot analysis 结果提示抑制剂 SB203580,SP600125,PDTC 单独或者与sfn共同作用均可抑制TNF-α，IL-6，IL-1β,iNOS的蛋白表达;sfn+U0126可以明显抑制TNF-α,IL-6，IL-1β,iNOS的蛋白表达,U0126单独组只能抑制IL-1β,iNOS的蛋白表达。5、Western blot analysis 结果提示 MAPK 的三种抑制剂(SB203580,U0126,SP600125)均可以明显抑制NF-kBp65的磷酸化。6、CCK-8和免疫荧光的结果提示sfn间接保护了小胶质细胞介导神经元损伤中神经元的活性和形态。7、Western blot analysis结果提示sfn间接抑制了小胶质细胞介导的神经元程序性坏死而不是凋亡;无论sfn是否加入,抑制剂(SB203580+SP600125+U0126+PDTC)处理组均可抑制 RIPK3,MLKL 而不是 caspase-3,Bax的蛋白表达。8、Western blot analysis 结果提示 sfn 通过 p38,JNK，NF-kB p65 而不是ERK1/2信号通路抑制小胶质细胞介导的神经元程序性坏死。结论1、sfn抑制了 LPS诱导BV-2细胞的激活。2、sfn抑制了 LPS激活BV-2细胞产生的炎症介质的表达以及上清培养基中TNF-α，IL-6的释放。3、在LPS激活BV-2细胞的过程中,sfn抑制了 MAPK和p65的磷酸化。4、MAPK和NF-kB的抑制剂抑制了炎症介质的释放,MAPK是NF-kB p65的上游通路。5、在小胶质细胞介导的神经元损伤中sfn间接保护了神经元的细胞活性及形态。6、sfn间接抑制了小胶质细胞介导的神经元程序性坏死。7、sfn通过p38,JNK,NF-kBp65而不是ERK1/2信号通路抑制小胶质细胞介导的神经元程序性坏死。

关键词： sfn 炎症小胶质细胞 MAPK NF-кB 程序性坏死

sfn通过增强RIPK3介导的程序性坏死促进缺血和肾毒性AKI模型的肾功能障碍

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SFN通过增强RIPK3介导的程序性坏死促进缺血和肾毒性AKI模型的肾...

作者：王芳安徽医科大学

学位级别：硕士

急性肾损伤(Actue kidney injury,AKI)是临床常见的危重病症之一。然而,目前尚无有效的治疗靶点。其病理特征是炎症反应、氧化应激和肾小管上皮细胞程序性死亡等。通过同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolut... 详细信息

急性肾损伤(Actue kidney injury,AKI)是临床常见的危重病症之一。然而,目前尚无有效的治疗靶点。其病理特征是炎症反应、氧化应激和肾小管上皮细胞程序性死亡等。通过同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantification,i TRAQ)技术进行蛋白质组学分析,我们发现Stratifin(sfn)蛋白在缺血再灌注(Ischemia-Reperfusion,I/R)小鼠中高表达。sfn是高度保守的可溶性酸性蛋白14-3-3家族成员之一,它能够调控细胞多种重要的生命活动,包括细胞周期、细胞生长发育、细胞生存和死亡以及基因转录等。然而,sfn对AKI功能的影响和作用机制目前尚未明确。因此,本研究旨在探讨sfn在AKI中的作用。在体内实验中,我们分别建立慢病毒介导的sfn在体沉默缺血再灌注和肾毒性AKI小鼠模型。同时,在体外实验中,我们在人的肾小管上皮细胞中沉默sfn,再用顺铂或缺氧再复氧处理。另外我们还在RIPK3敲除细胞株上过表达sfn进行反向验证sfn的作用位点。体内外结果表明,敲低sfn可显著减轻AKI小鼠的肾功能和组织学损伤。且体内外敲低sfn可下调顺铂诱导的程序性细胞死亡和炎症反应。我们的研究结果提示sfn与RIPK3结合能够促进坏死与炎症的发生,且在RIPK3敲除细胞株上过表达sfn后,结果表明肾损伤并不能加重。综上所述,我们的结果表明,sfn通过与RIPK3相互作用增强顺铂或I/R诱导的程序性细胞死亡和炎症进而加重AKI,sfn可能是AKI的潜在防治靶点。此课题的研究内容主要包括以下四个部分:1.探究sfn在急性肾损伤中的表达水平(1)体外实验:在人的肾小管上皮细胞(HK2)上,分别用顺铂和缺氧复氧刺激后,通过Western blot检测sfn的表达水平,实验结果发现在顺铂和缺氧复氧刺激的HK2细胞中,sfn蛋白的表达水平显著上调;(2)体内实验:将正常的C57BL/6雄性小鼠(约22-25 g)随机分为正常对照NC组、CIS组(Cisplatin 20 mg/kg)、缺血再灌注组(缺血40 min,再灌注24 h),顺铂组以20 mg/kg的剂量腹腔注射顺铂,正常组注射生理盐水作为对照,建立顺铂诱导的急性肾损伤模型。缺血再灌注组小鼠在缺血40分钟再灌注24 h,随后在麻醉情况下处死小鼠,收集血清和组织样本。Western blot结果表明在两种AKI小鼠中sfn的表达也是明显升高的,这与我们的测序结果还有体外验证结果一致。另外与正常肾脏组织样本相比,sfn在急性肾损伤患者的肾脏组织上表达升高。2.敲低sfn减轻顺铂诱导的急性肾损伤(1)体外实验:以人肾小管上皮细胞(HK2)为实验对象,随机分为四组:正常对照组(NC)、CIS组(CIS)、sfn沉默组(KD)、CIS+sfn沉默组(CIS+KD)。Western blot以及免疫荧光结果表明,当sfn沉默后,可以显著减轻顺铂诱导的肾小管细胞损伤。(2)体内实验:将C57BL/6雄性小鼠(约22-25 g)随机分为正常对照NC组、CIS组(Cisplatin 20 mg/kg)、sfn沉默组(尾静脉注射sh RNA包装的慢病毒)、CIS+sfn沉默组(Cisplatin 20 mg/kg+尾静脉注射sh RNA包装的慢病毒)每组6只。通过PAS糖原染色检查小鼠的肾脏病理学情况,以及肌酐和尿素氮试剂盒检测血清中血清Cr和BUN水平。Kim-1的Western blot和免疫荧光结果表明体内敲低sfn可以明显减轻顺铂诱导的急性肾损伤,改善肾功能。3.敲低sfn降低顺铂诱导的炎症反应(1)体外实验:在顺铂和缺氧复氧两种细胞损伤模型中,通过Real-time PCR技术同样证实了敲低sfn可以降低炎症因子TNF-α,Mcp-1,IL-1β和IL-6的m RNA水平。(2)体内实验:在顺铂诱导的AKI中,通过Real-time PCR技术检测TNF-α,IL-1β和IL-6的m RNA水平,免疫组化技术检测巨噬细胞标记物F4/80+和炎症因子TNF-α表达。实验结果显示,敲低sfn可以减轻顺铂诱导的AKI小鼠的炎症反应;4.敲低sfn减轻顺铂诱导的程序性坏死(1)体外实验:分别在顺铂和缺氧复氧模型中,运用免疫荧光单染、双染和Western blot等技术检测程序性坏死关键蛋白RIPK1/RIPK3/MLKL的表达情况,以及RIPK3与sfn的结合情况。此外,我们构建了RIPK3敲除细胞株,进一步验证sfn与程序性坏死蛋白RIPK3之间的关系。免疫荧光结果可知,在顺铂和缺氧复氧刺激下上调了MLKL的磷酸化水平,膜转位情况加重,沉默sfn后p-MLKL膜转位情况减少。同时也抑制了程序性坏死关键

关键词：急性肾损伤 sfn 程序性细胞死亡 RIPK3

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sfn基因治疗促进创面愈合的在体研究

SFN基因治疗促进创面愈合的在体研究

作者：邵蕾西北大学

学位级别：硕士

研究背景创面愈合是外科学的主要问题之一。近期有研究表明通过对Hippo通路中关键组成元件Yap的调控可以促进创面愈合。sfn作为14-3-3家族成员之一,调节信号转导通路及细胞周期,调节细胞增殖,分化,存活,凋亡。已有报道证明sfn蛋白通过... 详细信息

研究背景创面愈合是外科学的主要问题之一。近期有研究表明通过对Hippo通路中关键组成元件Yap的调控可以促进创面愈合。sfn作为14-3-3家族成员之一,调节信号转导通路及细胞周期,调节细胞增殖,分化,存活,凋亡。已有报道证明sfn蛋白通过与家族其他成员发生同源或是异源二聚化影响Yap的核浆穿梭。因此,我们推测截短型sfn可以通过控制Hippo通路中Yap的核浆穿梭调节表皮细胞增殖及肉芽组织形成。基于这些研究,我们设计了缺少C端的40个氨基酸的截短型sfn,它与14-3-3家族成员形成异源二聚体影响了该家族与Yap的结合,导致Yap发生核转位,Yap与PP2A结合进入到细胞核,与TEAD发生作用,共同起始转录,因而,表皮细胞持续增殖,促进创面愈合。实验目的探索野生型和截短型sfn基因治疗对创面愈合的影响,分析截短型sfn体内影响Yap胞浆分布来调节Hippo信号通路促进表皮细胞增殖的分子机制,为基因治疗创面愈合的高效性提供科学依据。实验方法1)利用RT-PCR扩增目的基因,分子克隆技术对野生型及截短型真核表达载体进行构建;2)使用Si02法大提质粒并使用TritonX-114等温相分离法去除内毒素;3)将40只8w的健康雌性C57小鼠随机分为5组,每只小鼠麻醉后背部脱毛,在脊柱中线两侧构建小鼠全层皮肤缺损模型,PEI体内介导F-127,空载体pSecX,野生型pSecX-sfn1和截短型pSecX-sfn2的基因治疗,在各组小鼠治疗第3d,第5d,第7d伤口组织取材,测量伤口愈合面积,分析血管化,对组织包埋切片,进行HE染色和Masson染色,进一步通过再上皮化及再生胶原纤维探讨该基因对创面愈合的治疗效果。实验结果1)成功构建截短型和野生型真核表达载体,通过双酶切及测序鉴定了其正确性;2)使用Si02等温相内毒素去除法提取到高纯度质粒;3)基因治疗小鼠创面愈合。第3d时,截短型sfn2治疗组残余伤口面积64.43±1.18mm2,伤口边缘有少量较厚再上皮化和胶原纤维生成,各组均有肉芽组织形成。治疗第5d时,治疗组与对照组统计学均有显著性差异Psfn1治疗组残留伤口面积为70.94±3.09mm2,再上皮化和胶原纤维最少,伤口附近的血管化较为丰富,截短型sfn2治疗组的愈合速率远远超过其他组,残留伤口面积仅剩16.02±2.59mm2,增殖的表皮细胞数量及沉积的胶原纤维最多,伤口及其周围血管化较少。治疗第7d时,各组表皮细胞由边缘向中心位置增殖迁移,截短型sfn2治疗组与野生型sfn1治疗组统计学差异显著Psfn2治疗组完全再上皮化,大量胶原纤维排列在表皮细胞下,血管化较少,结果显示截短型pSecX-sfn2促进伤口愈。

关键词： sfn 创面愈合基因治疗

sfn激活Nrf2对急性低氧运动小鼠骨骼肌LDH表达及活性的影响

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SFN激活Nrf2对急性低氧运动小鼠骨骼肌LDH表达及活性的影响

作者：李祥宁北京体育大学

学位级别：硕士

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)在骨骼肌抗氧化和有氧代谢中起重要作用。萝卜硫素(Sulforaphane,sfn)是公认的Nrf2激活剂,广泛存在于十字花科植物中。本研究拟通过给予sfn,探讨对小鼠低氧下耐力运动能力和骨骼肌乳... 详细信息

Nuclear factor erythroid 2-related factor 2(Nrf2)在骨骼肌抗氧化和有氧代谢中起重要作用。萝卜硫素(Sulforaphane,sfn)是公认的Nrf2激活剂,广泛存在于十字花科植物中。本研究拟通过给予sfn,探讨对小鼠低氧下耐力运动能力和骨骼肌乳酸代谢的影响,为今后Nrf2激活和乳酸代谢方面相关的研究提供实验依据,具有一定的参考价值。方法:采用雄性C57BL/6J小鼠,随机分为:sfn运动组、PBS运动组、sfn安静对照组和PBS安静对照组,每组9只。sfn运动组和PBS运动组在氧浓度为11.2%(模拟4500 m海拔高度)的低氧房内,进行一次性递增负荷的跑台运动。开始时小鼠以10m/min的速度跑5分钟进行热身,随后每三分钟速度增加一个等级,每个等级的增加幅度为3m/min,直到小鼠力竭。运动前72、48、24和3h分别腹腔注射sfn(25mg/kg体重)或等体积的PBS。运动后即刻处死,眼球取血和取骨骼肌组织。EKF乳酸仪测定血乳酸浓度,Western Blotting测定骨骼肌Nrf2、磷酸化-Nrf2(P-Nrf2)、乳酸脱氢酶 A(Lactic dehydrogenase A,LDH-A)和乳酸脱氢酶 B(Lactic dehydrogenase B,LDH-B)蛋白表达,试剂盒分别测定催化丙酮酸向乳酸转化和催化乳酸向丙酮酸转化的LDH活性。结果:(1)sfn运动组小鼠的运动距离和时长显著高于PBS运动组,且运动后即刻血乳酸浓度显著低于PBS运动组;(2)sfn运动组和sfn安静对照组的Nrf2和P-Nrf2蛋白表达量显著高于相应PBS运动组和PBS安静对照组;(3)sfn运动组催化乳酸转化为丙酮酸的LDH活性和LDH-B蛋白表达量均显著高于PBS运动组;sfn运动组LDH-A蛋白表达量无明显变化,但催化丙酮酸转化为乳酸的LDH活性显著低于PBS运动组。结论:低氧运动前给予sfn,可显著激活小鼠骨骼肌Nrf2,增加骨骼肌催化乳酸向丙酮酸转化的LDH表达和活性,促进骨骼肌乳酸代谢,从而降低血乳酸浓度,这些可能是提高小鼠低氧下运动耐力的重要因素。

关键词： Nrf2激活 sfn 乳酸脱氢酶乳酸代谢骨骼肌

基于LTE-Advanced系统的无线网络规划中sfn技术的研究

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基于LTE-Advanced系统的无线网络规划中SFN技术的研究

作者：王玉娟北京邮电大学

学位级别：硕士

随着LTE-Advanced技术越来越受到通信界的重视,无线网络规划在LTE-Advanced系统下的不断被优化。LTE-Advanced新技术中涉及到sfn技术,该技术对网络规划的优化、组网和小区间干扰抑制都有重要作用。本论文针对无线网络规划中小区间干扰问... 详细信息

随着LTE-Advanced技术越来越受到通信界的重视,无线网络规划在LTE-Advanced系统下的不断被优化。LTE-Advanced新技术中涉及到sfn技术,该技术对网络规划的优化、组网和小区间干扰抑制都有重要作用。本论文针对无线网络规划中小区间干扰问题,提出了相应的改善算法sfn算法,并完成编写和测试了相应的网络规划软件实现工具。论文具体工作主要包括：(1)提出了sfn技术的多RRU共小区技术,该技术对高铁场景、干扰改善场景和室内覆盖场景都有重要作用,并且有不同的组网方式,这些都有助于于无线网络规划的优化工作。本论文主要针对干扰改善场景进行算法建模,实现改善小区间干扰的功能。(2)sfn技术应用到容量仿真中去,针对容量的软件实现工具,设计算法建模和模块接口,并依此对该规划软件完成了实现。在对sfn算法建模的过程中,实现了sfn小区判定、用户初始路损列表计算和干扰计算的设计方法。能够结合sfn的特性,添加到容量仿真中,完成实际的优化效果。(3)在本论文的最后利用该网络规划软件,结合不同地图场景信息,对容量仿真结果进行分析对比,主要比较了分别设定为sfn小区情况和非sfn小区的情况,得出在sfn小区的情况下仿真具有更佳的效果,完成了网络规划的优化任务。最后对sfn技术后续的研究进行了展望。

关键词： LTE-Advanced 无线网络规划 sfn 容量仿真

circFIP1L1海绵吸附miR-1253调控sfn影响鼻咽癌放疗敏感性

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circFIP1L1海绵吸附miR-1253调控SFN影响鼻咽癌放疗敏感性

作者：姜涛南华大学

学位级别：硕士

目的:揭示circFIP1L1在鼻咽癌(NPC)放疗中的作用,阐明circFIP1L1-miR-1253-sfn信号轴在NPC放射治疗中的分子机制,为逆转NPC放射抗性,提高放疗效果,为临床NPC放射治疗提供有效的靶点。方法:(1)通过高通量测序获得鼻咽癌患者放疗前后血清c... 详细信息

目的:揭示circFIP1L1在鼻咽癌(NPC)放疗中的作用,阐明circFIP1L1-miR-1253-sfn信号轴在NPC放射治疗中的分子机制,为逆转NPC放射抗性,提高放疗效果,为临床NPC放射治疗提供有效的靶点。方法:(1)通过高通量测序获得鼻咽癌患者放疗前后血清circRNA(环状RNA)差异表达谱;(2)检测NPC放疗病人血清circFIP1L1的变化:收集放疗前后的鼻咽癌患者血清标本,TRIzol试剂提取总RNA,设计circFIP1L1的背靠背引物,qRT-PCR检测circFIP1L1表达情况;(3)研究放射对NPC细胞circFIP1L1的影响:采用低剂量持续放射法建立放射抗拒鼻咽癌细胞株5-8F-IR,6-10B-IR,qRT-PCR检测circFIP1L1/miR-1253/sfn表达情况;(4)通过RNA免疫共沉淀(RIP)实验分析circFIP1L与miR-1253的关系;(5)研究miR-1253对circFIP1L1和sfn表达的影响:转染miR-1253 mimic及miR-1253 inhibitor到5-8F细胞,RT-PCR检测circFIP1L1和sfn表达变化;(6)研究circFIP1L1影响NPC细胞放射敏感性的分子机制:构建circFIP1L1过表达载体,qRT-PCR检测sfn的表达水平,与空载体对照组比较,观察circFIP1L1对sfn的作用;放射处理后,通过流式细胞术、MTT和集落形成分析鼻咽癌5-8F细胞的细胞周期、凋亡以及放射敏感性变化;结果:(1)获得了鼻咽癌患者放疗前后血清circRNA差异表达谱;(2)鼻咽癌患者放疗后血清circFIP1L1表达升高;(3)应用直线加速器6MV-X射线持续低剂量照射5-8F细胞株,放射总剂量34Gy,筛选放射抗拒细胞株5-8F-IR,细胞增殖测定和流式细胞术验证5-8F-IR为放射抗拒细胞;(4)qRT-PCR检测放射抗拒5-8F-IR,6-10B-IR细胞,与对照组相比,sfn,circFIP1L1均表达降低(Psfn表达降低,而miR-1253 inhibitor组表达增加(P0.05);(7)过表达circFIP1L1后,sfn表达水平上调(Psfn的表达;(2)过表达circFIP1L1,能够导致鼻咽癌5-8F细胞周期阻滞在G2/M期,增加NPC细胞的放射敏感性。

关键词：鼻咽癌环状RNA miRNA sfn 放射敏感性

sfn蛋白对PCV2感染PK-15细胞的功能研究

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SFN蛋白对PCV2感染PK-15细胞的功能研究

作者：顾玮华中农业大学

学位级别：硕士

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)是迄今发现的一种最小的动物病毒,具有致病性,可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。其主要的临床表现为：呼吸道症状、贫血、黄疸、生长迟缓和进行性消瘦等。PCV2能引起机体的免疫抑制... 详细信息

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type2, PCV2)是迄今发现的一种最小的动物病毒,具有致病性,可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)。其主要的临床表现为：呼吸道症状、贫血、黄疸、生长迟缓和进行性消瘦等。PCV2能引起机体的免疫抑制,易与多种细菌、病毒混合感染。1991年首次在加拿大南部发现PMWS,我国于2000年证实在猪群中存在PCV2的感染。目前该病已遍及世界多个国家和地区,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。14-3-3蛋白是一类能与磷酸化蛋白结合或分离,调节细胞生理功能活性的蛋白质。其具有伴侣蛋白的性质,广泛参与细胞周期的调控,细胞的增殖与分化,信号转导,DNA损伤修复,肿瘤的形成等生理活动。14-3-3蛋白属于一类高度保守的蛋白质家族,在真核动物中具有高度保守性,按其蛋白结构的亚基不同,分为7个亚型(a,γ,β,η,θ,σ和ζ)。其中14-3-3σ蛋白又称为stratifin(sfn),分子大小约为28kDa。研究表明,14-3-3σ可与细胞周期蛋白复合物结合,调控病毒在细胞内的复制;还能与一些抑癌基因相互作用,调节细胞周期的检查点,对细胞的增殖起重要的调控作用。本课题是研究14-3-3a对PK-15细胞的作用,及其对PCV2增殖的影响,结果如下：1.构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-sfn根据GenBank上公布的猪sfn基因序列(GI：113205699)设计引物,通过RT-PCR方法扩增了猪sfn基因的CDS序列,将之插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达质粒,命名为pcDNA3.1(+)-sfn。通过PCR扩增、酶切鉴定及测序比对分析,发现该序列与GenBank中登录号为DQ445254(GI:90811814)的猪sfn基因同源性为99%。将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-sfn转染到PK-15细胞中,通过间接免疫荧光和Western Blot进一步分析证实pcDNA3.1(+)-sfn构建成功。荧光显微镜观察sfn在细胞浆和细胞核中都有分布。2.超表达sfn对PCV2增殖的影响将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-sfn转染到PK-15细胞中,24h后接种PCV2病毒,观察接毒后不同时间点转染sfn对病毒滴度的影响。实验表明,sfn不利于PCV2在细胞内的复制,差异显著(p≤0.05或p≤0.01)。随着时间的变化,这种抑制作用持续稳定,在12、24、36h时PCV2的拷贝数分别是对照组的0.97、0.86、0.9倍,sfn有可能在PCV2感染和复制的过程中起到抑制病毒增殖的作用。***2和sfn基因对PK-15细胞周期的影响鉴于sfn对细胞周期的作用,为了揭示sfn对PCV2增殖的影响,将pcDNA3.1(+)-sfn转染到PK-15细胞后,用流式细胞仪检测不同时间各时相的分布情况,发现随着时间的推移,sfn使PK-15细胞的S期延长,差异显著(p≤0.05或p≤0.01),表明sfn对细胞周期产生阻滞作用。转染sfn于PK-15细胞24h后接种PCV2,于接毒后不同时间点观察对细胞周期的影响。结果显示随着时间的推移,接种PCV2的细胞周期S期增大,而转染了sfn的PK-15细胞S期的延长更为显著,同时G2/M期处于静息状态。

关键词： sfn PK-15细胞真核表达细胞周期 PCV2

PT5779 sfn适配器在地面数字电视广播单频网中的应用

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广播与电视技术 2004年第11期31卷 91-94页

作者：岑斌韦志勇广东省广播电视技术中心电视调频发射总台

本文对地面数字电视广播单频网的技术要求、规划实施作了简单介绍,并进一步对单频网同步的基本原理、PT5779sfn适配器的主要功能、实际应用经验等作了详细介绍。

关键词：单频网地面数字电视广播 sfn 适配器网同步主要功能基本原理实际应用技术要求