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Multi-omics approaches identify sf3b3 and SIRT3 as candidate autophagic regulators and druggable targets in invasive breast carcinoma

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Acta Pharmaceutica Sinica b 2021年第5期11卷 1227-1245页

作者： Shouyue Zhang Jin Zhang Yang An Xiaoxi Zeng Ziyi Qin Yuqian Zhao Heng Xu bo Liu State Key Laboratory of biotherapy and Cancer Center West China HospitalSichuan UniversityChengdu 610041China Department of Laboratory Medicine State Key Laboratory of BiotherapyWest China HospitalSichuan UniversityChengdu 610041China Department of Plastic Surgery Peking University Third HospitalBeijing 100191China Division of Plastic Surgery Brigham and Women's HospitalHarvard Medical SchoolBostonMA 02115USA West China biomedical big Data Center West China HospitalSichuan UniversityChengdu 610041China School of Pharmaceutical Sciences Health Science CenterShenzhen UniversityShenzhen 518060China

Autophagy is a critical cellular homeostatic mechanism,and its dysfunction is linked to invasive breast carcinoma(bRCA).Recently,several omics methods have been applied to explore autophagic regulators in bRCA;however,more reliable and robust approaches for identifying crucial regulators and druggable targets remain to be discovered.Thus,we report here the results of multi-omics approaches to identify potential autophagic regulators in bRCA,including gene expression(EXP),DNA methylation(MET)and copy number alterations(CNAs)from The Cancer Genome Atlas(TCGA).Newly identified candidate genes,such as sf3 b3,TRAPPC10,SIRT3,MTERFD1,and FbXO5,were confirmed to be involved in the positive or negative regulation of autophagy in bRCA.sf3 b3 was identified firstly as a negative autophagic regulator,and siRNA/shRNA-sf3 b3 were shown to induce autophagyassociated cell death in in vitro and in vivo breast cancer models.Moreover,a novel small-molecule activator of SIRT3,1-methylbenzylamino amiodarone,was discovered to induce autophagy in vitro and in vivo.Together,these results provide multi-omics approaches to identify some key candidate autophagic regulators,such as the negative regulator sf3 b3 and positive regulator SIRT3 in bRCA,and highlight sf3 b3 and SIRT3 as new druggable targets that could be used to fill the gap between autophagy and cancer drug development.

关键词： Invasive breast carcinoma Multi-omics approach SIRT3 sf3b3 Autophagic regulator Anti-proliferation Migration Druggable target

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百草枯通过活性氧介导的长链非编码RNA NR＿030777与sf3b3的相互调控在神经元损害中的作用

百草枯通过活性氧介导的长链非编码RNA NR＿030777与SF3B3的相互...

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作者：王俊翔福建医科大学

学位级别：硕士

目的:在课题组前期研究中发现:百草枯（PQ）损害神经元过程中经活性氧诱导长链非编码RNA NR＿030777表达上升,高表达的NR＿030777在PQ致神经元损害中通过促进细胞增殖活力增高,调控细胞周期以及抑制细胞凋亡等方式发挥神经保护作用。为... 详细信息

目的:在课题组前期研究中发现:百草枯（PQ）损害神经元过程中经活性氧诱导长链非编码RNA NR＿030777表达上升,高表达的NR＿030777在PQ致神经元损害中通过促进细胞增殖活力增高,调控细胞周期以及抑制细胞凋亡等方式发挥神经保护作用。为了更加明确NR＿030777的作用机制,通过标记RNA亲和纯化（TRAP）技术,富集到剪接因子3b亚基3（sf3b3）,提示sf3b3可与NR＿030777直接结合发挥其生物学作用。本研究旨在通过基因编辑等技术手段,明确sf3b3是否在PQ致神经元损害中发挥作用,同时,观察敲低或过表达sf3b3是否会影响NR＿030777的表达,再进一步探讨sf3b3及NR＿030777在PQ致神经元损害中的作用机制。方法:（1）0、100、200μM PQ处理Neuro-2a细胞24 h后,Western blot（Wb）检测sf3b3蛋白表达水平;（2）利用慢病毒载体,构建sf3b3敲低以及过表达的细胞系,采用CCK8实验以及酪氨酸羟化酶（TH）等帕金森病相关蛋白表达水平评估细胞退行性损害;（3）利用q RT-PCR检测NR＿030777及其同源基因Zfp326 m RNA表达情况,观察NR＿030777与Zfp326的可变剪接变化;（4）通过检测N6-甲基腺苷（mA）甲基转移酶和去甲基化酶蛋白表达情况,证明sf3b3对mA修饰的影响;（5）加入Hoechst和7-AAD染料,以及通过检测凋亡相关蛋白乳腺癌缺失基因-1（DbC-1）观察细胞凋亡水平变化;（6）通过检测微管相关蛋白1轻链3b（LC3b）等自噬相关蛋白表达变化,阐明sf3b3对自噬的影响;（7）使用活性氧清除剂（NAC）及过氧化氢（HO）进行干预,检测sf3b3蛋白表达变化,并用血红素加氧酶1（HO-1）蛋白和脂质过氧化探针评估sf3b3对细胞氧化应激方面的影响;（8）敲低及过表达NR＿030777后检测sf3b3 m RNA表达水平,探究NR＿030777对sf3b3 m RNA表达的影响。结果:第一部分PQ通过下调sf3b3蛋白表达致神经元退行性损害（1）200μM PQ处理Neuro-2a细胞24 h后,sf3b3蛋白表达减少（Psf3b3细胞系构建成功后,0、100、200μM PQ处理Neuro-2a细胞24 h后,细胞活力逐渐下降,敲低sf3b3细胞活力进一步下降,过表达sf3b3促进细胞活力升高（P3）敲低sf3b3以及200μM PQ处理Neuro-2a细胞24 h后,TH蛋白表达减少,过表达sf3b3能够回复PQ引起的TH表达减少（Psf3b3在PQ致神经元细胞损害中发挥作用的机制（1）sf3b3过表达上调NR＿030777表达,敲低sf3b3减少PQ引起的NR＿030777表达上升,敲低及过表达sf3b3均能引起NR＿030777/Zfp326比例较PQ组上升（P30777上存在3个可能性较高的甲基化位点,PQ处理24 h后METTL3蛋白表达升高趋势（P>0.05）,FTO蛋白表达降低（P=0.052）,过表达sf3b3后METTL3蛋白表达上升,FTO蛋白表达有进一步降低的趋势（Psf3b3则趋势相反（P>0.05）;（3）流式细胞术发现PQ处理以及过表达sf3b3均会使细胞凋亡水平上升,过表达sf3b3还能促进DbC-1表达（Psf3b3促进PQ诱导的LC3b-II蛋白表达上升,过表达sf3b3则抑制LC3b-II蛋白表达（Psf3b3表达下调,且50及100μM HO也能下调sf3b3的表达,敲低sf3b3后,PQ引起的HO-1蛋白表达上调被部分回复,而过表达sf3b3会上调HO-1蛋白表达（P30777上调sf3b3 m RNA表达,而过表达NR＿030777则下调sf3b3 m RNA表达（Psf3b3蛋白表达,引起TH蛋白表达进一步减少,而过表达sf3b3能够增加细胞活力,回复PQ导致的TH蛋白表达下降;（2）敲低sf3b3能在PQ诱导LC3b-II蛋白表达的基础上,进一步促进LC3b-II蛋白表达,而过表达sf3b3则能抑制LC3b-II蛋白表达;（3）PQ通过增加ROS生成的方式下调sf3b3蛋白表达;（4）敲低sf3b3能够引起NR＿030777的表达减少,反之,过表达NR＿030777会导致sf3b3的表达减少。

关键词：百草枯帕金森病 sf3b3 氧化应激自噬

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sf3b3介导的ATP2b4选择性剪接参与膀胱癌的进展

SF3B3介导的ATP2B4选择性剪接参与膀胱癌的进展

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作者：成聪长江大学

学位级别：硕士

背景:膀胱癌(bladder urothelial cell carcinoma)在中国甚至在世界范围内的泌尿系肿瘤中属于常见的一类恶性肿瘤,每年在全世界范围内新诊断的病例,有43万例左右,在所有肿瘤中排名第9位,每年造成的死亡病例约为16.5万例,膀胱癌排名第13... 详细信息

背景:膀胱癌(bladder urothelial cell carcinoma)在中国甚至在世界范围内的泌尿系肿瘤中属于常见的一类恶性肿瘤,每年在全世界范围内新诊断的病例,有43万例左右,在所有肿瘤中排名第9位,每年造成的死亡病例约为16.5万例,膀胱癌排名第13位在所有肿瘤中。目前我们缺乏膀胱癌的有效的早期分子标志物指标,以及后续疾病复杂程度和复发转移情况的监测指标,因此想要诊断早期的膀胱肿瘤,以及想要了解膀胱肿瘤的进展,可以通过发现新的早期肿瘤分子标志物来实现,从而达到对膀胱肿瘤发生发展的密切检测。选择性剪接(Alternative Splicing),也可以称其为可变剪接,它是指一个前体m RNA通过不一样的剪接方式,从而产生不一样的m RNA剪接异构体的过程。因此由同一前体m RNA这种通过选择性剪接,从而产生的蛋白异构体,它可能具有不同的生物学功能,甚至是完全相反的生物学功能,这种选择性剪接模式可以极大的保证生物体蛋白质的多样性。基本上全部的人类基因,都会受到选择性剪接的调控,对于产生蛋白质多样性来说,这一机制是至关重要的。事实上,来自同一基因的不同剪接异构体可能具有不同甚至相反的功能。越来越多的证据表明,肿瘤的发生常常涉及选择性剪接的大规模改变。可变剪接正逐渐成为具有治疗前景的人类癌症的一个关键特征。我们前期的研究发现,剪接因子sf3b3调控EZH214号外显子的选择性剪接,EZH2的sf3b3表达和剪接模式可能具有预后和治疗潜力。这些研究表明,特异性的选择性剪接可以更有效提供肿瘤早期诊断和预后的分子标志物,并可能转化为有效的治疗靶点。然而,对于膀胱癌中异常剪接事件和潜在剪接机制的研究却很少。在本研究中,我们利用癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)的RNA测序数据,用生物信息学方法系统地识别了选择性剪接事件,并选择了包括膀胱癌中包含ATP2b4的卷曲线圈结构域在内的一系列显著选择性剪接事件进行进一步验证。另外,全基因组相关研究(GWAS)证实其多个单核苷酸位点多态性(SNP)被为严重恶性疟的耐药位点;且机制研究显示红细胞特异性ATP2b4增强子介导红细胞水合作用,从而影响疟疾易感性。除了在疟疾和心肌疾病等疾病中的研究以外,也有不少研究开始探讨钙转运通道和钙泵在肿瘤中的作用。在本研究中,我们评估了ATP2b4剪接模式在生存预测中的临床意义,并通过一系列的体内外实验检测了不同ATP2b4亚型在膀胱癌中的不同生物学功能。我们还证明了剪接因子sf3b3促进了ATP2b4 21号外显子的跳跃。在体外,下调sf3b3抑制细胞增殖、集落形成和细胞迁移,在体内抑制癌变。重要的是,sf3b3在膀胱癌中上调,并与ATP2b421号外显子的跳跃高度相关。值得注意的是,在膀胱癌中,sf3b3水平与较高的肿瘤分期和较差的总生存率相关。总体而言,本研究结果表明,sf3b3调节ATP2b421号外显子可变剪接的功能对其肿瘤促进作用有重要作用。方法:利用生物信息学方法,通过癌症基因组图谱中的外显子测序数据,识别膀胱癌中重要的外显子跳跃事件。半定量PCR和western blot用来验证不同转录本在膀胱癌组织、癌旁组织以及细胞系中的异常表达。将以ATP2b4为靶点的短发夹RNA和每个转录本过表达质粒导入膀胱癌细胞系,然后进行一系列的体外和体内功能测试实验。此外,我们还鉴定了一组剪接因子,并研究了它们在ATP2b4pre-m RNA剪接调控中的作用。统计分析采用双向方差分析和非配对研究t检验。结果:ATP2b4的Pre-mRNA生成两个转录本,全长转录本(ATP2b4-V1)和剪接转录本(ATP2b4-V2),其中剪接转录本跳过了21号外显子。与非癌组织相比,ATP2b4-V2在膀胱癌组织中过表达,但ATP2b4-V1仅在非癌组织和正常膀胱上皮细胞中检测到。在膀胱癌患者中,较高的splic-in指数与较好的生存率相关。体外功能实验表明,ATP2b4剪接转录本(ATP2b4-V2)促进了膀胱癌的增殖、迁移、侵袭和肿瘤发生,而全长转录本(ATP2b4-V1)则发生相反的功能。此外,我们发现sf3b3可促进ATP2b4 21号外显子的跳跃,从而导致ATP2b4-V2在膀胱癌中有较高比例和致癌率。结论:膀胱癌中ATP2b4的异常选择性剪接是由sf3b3调控的。

关键词：膀胱癌 ATP2b4 选择性剪接 sf3b3

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CDK7、SRp20和sf3b3在卵巢癌中的表达及其临床病理学意义

CDK7、SRp20和SF3B3在卵巢癌中的表达及其临床病理学意义

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作者：王晗青岛大学

学位级别：硕士

目的:探讨CDK7、SRp20和sf3b3在卵巢癌(尤其是浆液性癌)中的表达水平及其与临床病理特征的关系,分析卵巢浆液性癌(ovarian serous carcinoma,OSC)的发生、进展机制,并试图寻求新的治疗靶点,为其治疗提供新的思路。方法:收集OSC 110例,... 详细信息

目的:探讨CDK7、SRp20和sf3b3在卵巢癌(尤其是浆液性癌)中的表达水平及其与临床病理特征的关系,分析卵巢浆液性癌(ovarian serous carcinoma,OSC)的发生、进展机制,并试图寻求新的治疗靶点,为其治疗提供新的思路。方法:收集OSC 110例,浆液性交界性肿瘤(serous borderline tumor,SbT)26例,浆液性囊腺瘤(serous cystadenoma,SC)28例及正常输卵管组织30例。110例OSC中,高级别浆液性癌(high-grade serous carcinoma,HGSC)81例、低级别浆液性癌(low-grade serous carcinoma,LGSC)29例。采用免疫组织化学的方法检测CDK7、SRp20和sf3b3在上述病例中的表达情况。分析不同组别CDK7、SRp20和sf3b3的表达差异,并探讨OSC中CDK7与SRp20、sf3b3表达水平之间的关联性。分析CDK7、SRp20和sf3b3的表达水平与OSC临床病理特征之间的联系,并进行生存分析。另选取卵巢透明细胞癌(ovarian clear cell carcinoma,OCCC)27例及卵巢宫内膜样癌(ovarian endometrioid carcinoma,OEC)23例同时进行CDK7、SRp20和sf3b3免疫组化检测,表达结果与OSC比较,探索该三个指标在不同类型的卵巢癌中的表达差异。结果:1.CDK7在正常输卵管组织及浆液性肿瘤中的表达结果:CDK7在正常输卵管组织、SC、SbT、LGSC、HGSC中高表达率分别为0.0%(0/30)、0.0%(0/28)、3.9%(1/26)、10.3%(3/29)、72.8%(59/81)。CDK7在正常输卵管组织/SC与SbT、LGSC、HGSC各组中、以及SbT/LGSC与HGSC各组中的表达差异具有统计学意义(P均bT与LGSC两组中的表达差异不具有统计学意义(P均>0.05)。2.SRp20在正常输卵管组织及浆液性肿瘤中的表达结果:在正常输卵管组织、SC、SbT、LGSC、HGSC中高表达率分别为0.0%(0/30)、0.0%(0/28)、3.8%(1/26)、10.3%(3/29)、71.6%(58/81)。SRp20在正常输卵管组织/SC与SbT、LGSC、HGSC各组中、以及SbT/LGSC与HGSC各组中的表达差异具有统计学意义(P均bT与LGSC两组中的表达差异不具有统计学意义(P均>0.05)。3.sf3b3在正常输卵管组织及浆液性肿瘤中的表达结果:在正常输卵管组织、SC、SbT、LGSC、HGSC中高表达率分别为0.0%(0/30)、3.6%(1/28)、0.0%(0/26)、6.9%(2/29)、76.6%(62/81)。sf3b3在正常输卵管组织与SbT、LGSC、HGSC各组中、SC与LGSC中、以及SC/SbT/LGSC与HGSC各组中的表达差异具有统计学意义(P均bT、SbT与LGSC三组中的表达差异不具有统计学意义(P均>0.05)。4.CDK7、SRp20、sf3b3在不同类型的卵巢癌中的表达差异:CDK7、SRp20、sf3b3在OSC中的高表达率分别为56.3%(62/110),55.4%(61/110)和58.2%(64/110);在OCCC的高表达率分别为37.1%(10/27),18.5%(5/27)和33.3%(9/27);在OEC中的高表达率分别为30.4%(7/23),17.4%(4/23)和34.8%(8/23)。统计分析表明,CDK7在OSC和OCCC中(P=0.037)、SRp20在OSC和OCCC中(Psf3b3在OSC和OCCC中(P=0.032)的表达差异具有统计学意义;其余各组差异尚不具备统计学意义。5.CDK7的表达与SRp20、sf3b3的关联分析:在OSC中,CDK7的表达与SRp20、sf3b3分别存在关联(P均394、0.521。6.CDK7、SRp20和sf3b3的表达与OSC临床病理特征之间的关系:CDK7、SRp20和sf3b3的高表达常提示肿瘤病理高分级、术后3年内病情易出现进展(P均sf3b3的高表达常提示肿瘤处于晚期(III期/IV期),而SRp20的表达与肿瘤分期无关。SRp20的表达与患者年龄(P=0.016)、sf3b3的表达与术时转移(P=0.035)有关;三者的表达均与肿瘤直径无关(P值均>0.05)。7.生存分析提示:肿瘤病理分级、临床分期、CDK7、SRp20、sf3b3的表达情况均为影响患

关键词：卵巢癌 CDK7 SRp20 sf3b3 预后

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Lesion mimic phenotype of spl5 was negatively regulated by a splicing factor 3b subunit 3(sf3b3) gene in rice

Lesion mimic phenotype of spl5 was negatively regulated by a...

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中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会

作者： CHEN Xi-feng HAO Liang JIN Yang GU zhi-min MA bo-jun College of Chemistry and Life Sciences Zhejiang Normal University

A lesion-mimic phenotype in rice(Oryza sativa L.) spotted leaf5(spl5) indicates that wild-type SPL5 negatively regulates cell death and resistance responses.Previously,the spl5 gene was already mapped to the 80-kb region between two markers SSR7 and RM7121 through a map-based cloning approach.Here,we further showed that the spl5 gene was delimitated into a 15.l-kb genomic region by the high-resolution sequence target site(STS)markers.Subsequent sequencing in this region of spl5 mutant revealed that one candidate gene harbored a single-base deletion,resulting in a frame-shift mutation and a premature stop codon.biointormatic analysis showed that SPL5 gene encodes a putative splicing factor 3b subunit 3(sf3b3) and might be involved in splicing reactions of pre-mature RNAs participating in the regulation of cell death and resistance responses.Further analysis showed that wild-type SPL5 did functionally complement the spl5 phenotype.The data presented here clearly indicate that the SPL5 negatively regulates cell death and resistance responses via modulating RNA splicing in plants

关键词： rice lesion mimic mutant spl5 map-based cloning sf3b3

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