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Somatic second-hit mutations leads to polycystic liver diseases

World Journal of Gastroenterology 2013年第1期19卷 141-143页

作者： Jesús M Banales Patricia Munoz-Garrido Luis Bujanda Division of Hepatology and Gastroenterology Donostia Universitary HospitalBiodonostia Research InstituteE-20014 San SebastiánSpain Department of Liver and Gastrointestinal Diseases National Institute for the Study of Liver and Gastrointestinal Diseases(CIBERehdfunded by the Spanish Carlos III Institute)08036 BarcelonaSpain Ikerbasque Basque Foundation for Science48011 BilbaoSpain Spanish Association Against Cancer(AECC) 28040 MadridSpain

Polycystic liver diseases(PCLDs) are a heterogeneous group of genetic disorders characterized by the development of multiple fluid-filled cysts in the liver,which derive from cholangiocytes,the epithelial cells lining the bile *** these cysts grow,symptoms such as abdominal distension,nausea,and abdominal pain may *** may exist isolated(i.e.,autosomal dominant polycystic liver disease,ADPLD) or in combination with renal cystogenesis(i.e.,autosomal dominant polycystic kidney disease and autosomal recessive polycystic liver disease).The exact prevalence of PCLDs is unknown,but is estimated to occur in approximately 1:1000 *** the pathogenesis of each form of PCLD appears to be different,increasing evidences indicate that hepatic cystogenesis is a phenomenon that may involve somatic loss of heterozygosity(LOH) in those pathological conditions inherited in a dominant form.A recent report,using highly sophisticated methodology,demonstrated that ADPLD patients with a germline mutation in the protein kinase C substrate 80K-H(PRKCSH) gene mostly develop hepatic cystogenesis through a second somatic *** hepatocystin,the PRKCSH-encoding protein,was absent in the hepatic cysts with LOH,it was still expressed in the heterozygous *** the other hand,no additional trans-heterozygous mutations on the sec63 homolog(*** /sec63) gene(also involved in the development of PCLDs) were *** data indicate that PCLD is recessive at the cellular level,and point out the important role of hepatocystin loss in *** this commentary,we discuss the knowledge regarding the role of somatic second-hit mutations in the development of PCLDs,and the most relevant findings have been highlighted.

关键词： Polycystic liver diseases Cholangiocyte Cystogenesis Loss of heterozygosity Protein kinase C substrate 80K-H sec63

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SOX9在肝囊肿形成中的作用及机制研究

SOX9在肝囊肿形成中的作用及机制研究

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作者：陈丽琳中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

【研究背景及目的】肝囊肿是一组病因不同的异质性疾病,其中包括散发的单纯性肝囊肿和遗传性多囊肝病(polycystic liver diseases,PLD)两种主要类型。虽然此病患者大多表现为良性病程,但也有部分患者出现与囊肿增大及随后腹部器官受压... 详细信息

【研究背景及目的】肝囊肿是一组病因不同的异质性疾病,其中包括散发的单纯性肝囊肿和遗传性多囊肝病(polycystic liver diseases,PLD)两种主要类型。虽然此病患者大多表现为良性病程,但也有部分患者出现与囊肿增大及随后腹部器官受压相关的症状和并发症,如腹痛、早饱、食管返流或囊内出血、感染,甚至囊肿破裂等,极少数患者会因为囊肿体积过大、数量过多造成肝功能受损,甚至肝衰竭。目前此病的主要方法包括保守治疗、抽吸硬化疗法、开窗手术、肝部分切除及肝移植等。其中,肝部分切除术和肝移植是目前疗效确切的两种方法,但肝部分切除术作为一种有创手术,术后并发症较多,而肝移植在临床实践中受到诸多限制。因此,肝囊肿需要其他创新且有效的治疗方式,探索肝囊肿形成的分子机制有助于寻找新的治疗靶点。作为肝囊肿的主要发病类型之一,PLD可以以孤立的常染色体显性遗传多囊性肝病(autosomal dominant polycystic liver disease,ADPLD)发生,或者合并多囊性肾病(polycystic kidney diseases,PKD)出现。研究表明,遗传性PLD伴常染色体显性多囊肾病(PKD)由PKD1或PKD2胚系突变导致,而ADPLD可能由PRKCSH、sec63和LRP5等基因突变引起。与PLD相比,单纯性肝囊肿是散发的,其遗传背景目前尚不清楚。肝囊肿形成的病理生理学改变包括胆管板畸形(ductal plate malformation,DPM)及胆管上皮细胞异常增殖。胆管板畸形是指胆管发育过程中,胆管板重塑异常,具体可表现为胆管上皮细胞极性紊乱、初级纤毛装配及功能异常。sec63是一个内质网相关基因,参与蛋白质的共翻译及转运过程,其缺失突变会导致ADPLD的发生与发展。并且,敲除人胆管上皮细胞中的sec63会破坏初级纤毛的形成。可见,sec63在肝囊肿的形成中扮演重要角色。然而,sec63的转录调控尚未被阐明。性别决定区Y-框蛋白9(Sex-determining region Y-box protein 9,SOX9)在脑、肠、肺、肾、肝等多种组织类型和器官中表达,并控制多种细胞的分化。在肝脏中,SOX9主要表达于胆管上皮细胞,是最常用的胆管标志物之一。在肝内胆管发育过程中,SOX9决定了胆管形态发生的时机,调控了对称胆管结构的形成。有研究报道,SOX9控制胆管上皮细胞的分化、极性和纤毛的形成,并调节正常胆管发育所需的例如转化生长因子-β(TGF-β)、Notch和Hippo信号通路中信号分子的表达。以上结论表明SOX9在胆管发育和决定胆管上皮细胞命运中起到重要作用。课题组的前期工作证明了肝脏特异性敲除Sox9能够促进肝癌发生,在此过程中构建了肝脏特异性敲除Sox9的小鼠,意外观察到肝脏特异性敲除Sox9的小鼠在未经造模的情况下会自发形成肝囊肿,提示SOX9表达失调可能参与肝囊肿的形成。因此,基于以上研究背景及前期基础,本课题旨在进一步明确SOX9在肝囊肿形成过程中的作用,并深入探讨其分子机制。【实验方法】一、肝脏特异性敲除Sox9对小鼠肝囊肿形成的影响1.构建并鉴定Sox9小鼠。将Sox9小鼠与白蛋白驱动表达Cre重组酶的Alb-cre工具小鼠杂交,构建Sox9(Sox9:Alb-Cre)小鼠。PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型后进行分组。分别留取Sox9小鼠与Sox9小鼠肝脏,利用Western blot、免疫组化和免疫荧光检测肝组织中SOX9蛋白的表达水平。2.观察肝脏特异性敲除Sox9对小鼠肝囊肿形成的影响。分别在不同月龄处死Sox9小鼠与Sox9小鼠,通过大体观察小鼠肝脏表面与micro-CT观察小鼠肝脏内部的肝囊肿发生情况,对肝囊肿数量、大小及发生率等进行统计。并且采用H&E染色、天狼星红染色、免疫组化等方法对两组小鼠的肝组织进行组织病理学分析。同时评估丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、天冬氨酸转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)等小鼠血清肝功能指标。二、敲除/敲减SOX9对胆管上皮细胞增殖能力、极性及初级纤毛形成的影响1、在体外人肝内胆管上皮细胞中,通过小干扰RNA(siRNAs)敲减SOX9后,应用CCK-8试剂盒检测细胞活性,绘制生长曲线。2、在Sox9小鼠与Sox9小鼠体内利用Brd U标记方法检测敲除SOX9对胆管上皮细胞增殖能力的影响。3、在Sox9小鼠与Sox9小鼠体内利用免疫荧光共定位细胞增殖相关标志物—增殖细胞核抗原(PCNA)与胆管上皮细胞标志物—细胞角蛋白19(CK19),观察敲除SOX9对胆管上皮细胞增殖能力的影响。4、在Sox9小鼠与Sox9小鼠体内利用免疫荧光共定位细胞顶端极性标志物—骨桥蛋白(OPN)与胆管上皮细胞标志物—细胞角蛋白19(CK19)

关键词： SOX9 肝囊肿 sec63 胆管板畸形初级纤毛

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弓形虫ROP32与宿主相互作用蛋白的筛选及基因敲除虫株的构建

弓形虫ROP32与宿主相互作用蛋白的筛选及基因敲除虫株的构建

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作者：马秀英中国农业科学院

学位级别：硕士

弓形虫的棒状体(Roptry)是弓形虫顶端复合体上一类重要的分泌性器官,通过向宿主分泌大量的蛋白效应因子来调控膜系及骨架结构。棒状体蛋白(ROPs)可以与细胞的活性因子相互作用,从而阻断细胞内在的防御机制,使弓形虫成功实现胞内侵入、... 详细信息

弓形虫的棒状体(Roptry)是弓形虫顶端复合体上一类重要的分泌性器官,通过向宿主分泌大量的蛋白效应因子来调控膜系及骨架结构。棒状体蛋白(ROPs)可以与细胞的活性因子相互作用,从而阻断细胞内在的防御机制,使弓形虫成功实现胞内侵入、寄生及增殖。ROPs主要参与调节宿主细胞基因表达、修饰纳虫空泡、调节虫株毒力以及宿主细胞与弓形虫之间相互作用等各方面,是弓形虫侵入及复制过程中非常必要的分泌性蛋白。在棒状体分泌到宿主细胞中的ROPs中,有一类弓形虫特异性激酶蛋白家族(ROPK),可能广泛参与了与宿主细胞蛋白的相互作用。棒状体蛋白32(ROP32)是具有激酶活性的ROPK成员之一。生物信息学研究发现ROPK的特异性氨基酸位点大部分都很保守,但ROP32是唯一一个在P358氨基酸位点为组氨酸的激酶,而大部分激酶家族成员在该位点为脯氨酸,这预示着ROP32可能的特异性生物学功能。目前关于ROP32的具体功能还不明确。本研究通过大肠杆菌成功表达并纯化了ROP32编码的部分序列。利用构建的pGBKT7-ROP32诱饵质粒转化酵母菌株Y2H,通过表型从人源HFF文库中筛选与ROP32相互作用的宿主蛋白。结果表明pGBKT7-ROP32诱饵质粒无自激活和细胞毒性作用。通过酵母双杂交技术共筛选到了12个与ROP32有相互作用的宿主细胞蛋白。将得到的阳性克隆进行序列分析结果表明,筛选到的蛋白包括1个参与蛋白转运相关蛋白、1个凋亡相关蛋白、1个细胞骨架蛋白、1个参与能量转化的磷酸转移酶以及8个其它蛋白。利用Co-IP进一步验证了ROP32和sec63蛋白之间的特异性相互作用。为进一步研究弓形虫ROP32蛋白的功能,我们利用CRISPR/Cas9系统构建了一株ROP32基因缺失虫株,并初步分析了ROP32对虫体生长、复制及毒力的影响。综上所述,本研究成功表达了重组ROP32蛋白,并通过酵母双杂交系统筛选了与弓形虫ROP32有相互作用的宿主蛋白。ROP32与参与蛋白转运的sec63的相互作用提示了ROP32可能在弓形虫对营养物质和代谢物的运输过程中发挥作用。同时本研究构建了缺失ROP32基因的弓形虫虫株,为进一步深入研究ROP32蛋白的功能奠定了基础。

关键词：弓形虫棒状体蛋白 ROP32 CRISPR/cas9 酵母双杂交 sec63

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