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基于高分辨质谱技术的sars-cov-2 rbd重组蛋白疫苗电荷异质性表征分析

基于高分辨质谱技术的SARS-CoV-2 RBD重组蛋白疫苗电荷异质性表征...

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作者：陈全姚烟台大学

学位级别：硕士

近年来,covID-19大流行促进了重组蛋白疫苗研究的快速发展,公众对疫苗安全性与有效性的关注也达到了前所未有的高度。电荷异质性是重组蛋白产品的关键质量属性之一,它是指蛋白样品中存在着不同电荷状态的亚群,其成因复杂,涉及到多种蛋... 详细信息

近年来,covID-19大流行促进了重组蛋白疫苗研究的快速发展,公众对疫苗安全性与有效性的关注也达到了前所未有的高度。电荷异质性是重组蛋白产品的关键质量属性之一,它是指蛋白样品中存在着不同电荷状态的亚群,其成因复杂,涉及到多种蛋白质翻译后修饰及其他因素,并且对重组蛋白疫苗的纯度、稳定性和免疫原性具有潜在影响。国内外关于生物制品药学研究的指导原则中表明,需采用多种仪器和技术对重组蛋白类产品进行表征分析,充分理解产品的相关质量属性。然而,由于重组蛋白疫苗的分子量大、结构复杂以及分析技术发展有限等原因,针对重组蛋白疫苗电荷异质性相关的详细表征研究还较为缺乏。基于以上,本文以sars-cov-2 rbd重组蛋白疫苗为研究对象,采用成像毛细管等电聚焦电泳(icIEF)与质谱(MS)联用的分析技术,以及液质联用(LC-MS)分析技术,对该疫苗的电荷异质性进行表征分析,以期为该类疫苗的质量控制方法开发、审评审批和疫苗设计提供参考。研究内容主要包括以下三部分:第一部分:sars-cov-2 rbd重组蛋白疫苗电荷异质性质控方法的建立及应用优化并建立了基于icIEF技术的疫苗电荷异质性质控方法。疫苗样品等电点检测结果范围为p H 5.9到9.5。三批疫苗样品等电点三次重复检测结果的RSD%均小于0.5,结果证明所建立的方法具有良好的重复性。此外,采用建立好的icIEF方法对疫苗稳定性以及酶切去除N糖基化修饰和唾液酸修饰前后的疫苗样品进行了考察。去除N糖和唾液酸修饰后的疫苗样品,检测到酸性电荷异构体峰显著减少,这表明N糖型和唾液酸修饰显著影响疫苗蛋白的电荷异质性。第二部分:icIEF-MS在线/离线技术表征分析sars-cov-2 rbd重组蛋白疫苗电荷异质性icIEF-MS直连分析:疫苗蛋白在自然状态下检测到18个电荷异构体峰。解卷积结果显示:从碱性峰到酸性峰(P1～P18)分子量依次增大(85400～92500 Da),不同电荷异构体组分的糖型修饰存在差异;从P1～P18,各组分的唾液酸含量也呈增加趋势。结果进一步验证了该疫苗的电荷异质性与糖基化修饰相关,特别是与唾液酸修饰相关。icIEF离线收集:采用the CEInfinite icIEF毛细管电泳仪对疫苗的电荷异构体进行收集。18个电荷异构体峰共分为5段进行收集。亲和力分析:采用表面等离子共振(SPR)技术对收集到的电荷异构体组分以及去除N糖和唾液酸前后的疫苗样品与其配体之间的亲和力进行分析。结果显示,在体外试验中电荷异构体组分之间体外亲和力差异不显著,也未发现N糖基化和唾液酸修饰影响rbd疫苗与其受体的结合能力,但这些因素对疫苗诱导免疫反应能力的影响还需通过后续的动物体内试验来评价。第三部分:液质联用技术表征sars-cov-2 rbd疫苗电荷异质性相关糖基化修饰基于前两部分发现的糖基化修饰对电荷异质性的影响较大的研究结果。采用液质联用技术在完整蛋白层面、肽段层面与聚糖释放分析层面,对与rbd疫苗电荷异质性相关的糖基化修饰进行分析。得到疫苗样品的氧化、脱酰胺、二硫键、糖基化位点和糖型修饰等的翻译后修饰信息,以及N糖谱图和唾液酸含量信息。

关键词： sars-cov-2rbd重组蛋白疫苗 icIEF-MS UHPLC-MS/MS 电荷异质性

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