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木薯sad基因片段的克隆及其序列分析

广东农业科学 2009年第6期36卷 28-30,42页

作者：杨鹏雅王文泉周建国李开绵夏志强中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南儋州571737 中国热带农业科学院热带生物技术研究所海南海口571101

通过比较拟南芥和蓖麻的sad基因同源区域,设计引物并以木薯基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到长度为240 bp的基因片段,命名为木薯sad。序列相似性检索结果表明,木薯sad基因的核苷酸序列与基因库中登陆的大戟科植物蓖麻、千年桐的mRNA序... 详细信息

通过比较拟南芥和蓖麻的sad基因同源区域,设计引物并以木薯基因组DNA为模板进行PCR扩增,得到长度为240 bp的基因片段,命名为木薯sad。序列相似性检索结果表明,木薯sad基因的核苷酸序列与基因库中登陆的大戟科植物蓖麻、千年桐的mRNA序列同源性达94%,与大豆、芝麻、葵花等油料作物的mRNA序列同源性分别达到87%、86%和82%;系统进化分析进一步表明,木薯sad基因与大戟科植物蓖麻、麻疯树和千年桐的亲缘关系最近,该结果与传统分类学将木薯与蓖麻、千年桐和麻疯树归于大戟科的结论相符,而木薯sad基因与芝麻、大豆、莲花、葵花等植物种仁不饱和脂肪酸含量较高的植物在进化上具有较高的保守性。

关键词：木薯 sad基因克隆序列分析

根癌农杆菌介导的千年桐sad基因对产油酵母的遗传转化

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根癌农杆菌介导的千年桐SAD基因对产油酵母的遗传转化

作者：陈东亮中国林业科学研究院

学位级别：硕士

微生物油质资源的开发利用是解决能源危机的重要新途径之一。但微生物生产油脂成分复杂,难以满足生物柴油对长链单不饱和脂肪酸的要求。植物中的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,sad)催化在第9-10碳原子之间脱氢形成脂... 详细信息

微生物油质资源的开发利用是解决能源危机的重要新途径之一。但微生物生产油脂成分复杂,难以满足生物柴油对长链单不饱和脂肪酸的要求。植物中的△9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase,sad)催化在第9-10碳原子之间脱氢形成脂肪酸的第一个双键,直接决定植物储脂中不饱和脂肪酸的比例。近年来随着分子生物学技术的发展,利用外源基因调控生物代谢的研究受到关注,这无疑为产油菌种改良,指明了一个新的途径。本实验室克隆到了优良油料树种千年桐的sad基因,并构建了该基因的真菌表达载体pCAM2300-sad,期望通过将其导入产油真菌,调控其油脂代谢途径来提高产油菌油脂品质。本实验利用农杆菌介导法,对产油酵母浅白隐球酵母进行了遗传转化,并对农杆菌菌株,农杆菌及酵母农浓度,共培养时间,共培养期AS浓度等影响转化效率的关键因子进行了优化。结果表明:利用农杆菌菌株AGL-1介导,农杆菌浓度为1×109个细胞/mL,酵母浓度为5×106至1×107个细胞/mL,在含有AS 200μmol/L条件下共培养48 h可获得较高的转化率。PCR及RT-PCR检测表明,sad基因已成功转入浅白隐球酵母中,并能在浅白隐球酵母受体中转录成mRNA。对转基因菌株进行摇瓶发酵,测定生物量及油脂含量,得到油脂产量高于对照的菌株一株,编号E-2,其油脂产量为1.74 g/L,油脂含量为16.19g/L,分别提高了14.47%和9.39%。对9个转化子油脂脂肪酸组成进行气相色谱分析,油酸含量差距显著,其中有3株油酸比例高于对照,2株低于对照,4株变化不明显。其中X-1油酸比例最高,比对照提高了14.4%,同时棕榈酸比例下降了18.75%。同时本实验中对载体pCAM2300-sad进行改造,构建了含Zeocin筛选标记基因的载体pCAM2300-sadz,并用农杆菌介导法对优良产油酵母斯达氏油脂酵母进行了遗传转化,初步获得了一些转化子。本文通过农杆菌介导法实现了sad基因对浅白隐球酵母和胶粘红酵母中的遗传转化,并获得了转化菌株;通过气相色谱对浅白隐球酵母转化子油脂成分分析,最终筛选到了产油性能优良的转基因菌株;对农杆菌介导浅白隐球酵母的转化条件进行了优化,初步建立了农杆菌介导的产油真菌遗传转化体系,为进一步研究打下了基础。

关键词： sad基因浅白隐球酵母胶粘红酵母农杆菌介导法

外源sad基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响

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外源SAD基因在蛋白核小球藻中转化和表达及对脂肪酸组成的影响

作者：杨青峰广东海洋大学

学位级别：硕士

为了探究微藻硬脂酰载体蛋白去饱和酶(sad)基因在蛋白核小球藻不饱和脂肪酸合成调控中的作用,提高藻细胞中不饱和脂肪酸的含量,本文采用基因枪法将若夫小球藻的sad基因导入到蛋白核小球藻的叶绿体中,利用链霉素抗性筛选,经同质化培养,... 详细信息

为了探究微藻硬脂酰载体蛋白去饱和酶(sad)基因在蛋白核小球藻不饱和脂肪酸合成调控中的作用,提高藻细胞中不饱和脂肪酸的含量,本文采用基因枪法将若夫小球藻的sad基因导入到蛋白核小球藻的叶绿体中,利用链霉素抗性筛选,经同质化培养,成功获得了转化藻。以野生蛋白核小球藻为对照,对转化藻进行了PCR验证和荧光定量分析,并且对脂肪酸组成和sad基因在蛋白核小球藻不饱和脂肪酸合成过程中的调控作用进行了分析。本文系首次用基因枪法对蛋白核小球藻成功进行了叶绿体转化,并探究了sad基因对微藻不饱和脂肪酸合成的影响,加深了对微藻油脂合成调控机理的认识。本文的主要研究内容及结果如下:(1)确定了蛋白核小球藻基因工程筛选标记及对同源片段chlL基因进行了验证。通过研究蛋白核小球藻对6种抗生素的敏感性,结果表明链霉素浓度为200μg/mL时能在8天左右观察到蛋白核小球藻细胞全部死亡,确定aadA基因可作为蛋白核小球藻基因工程筛选标记;通过PCR扩增验证了chlL基因作为蛋白核小球藻叶绿体转化中同源片段的可行性。(2)成功构建了以chlL基因序列为同源片段、分别以莱茵衣藻叶绿体中的atpA和rbcL作为sad基因的启动子和终止子、aadA基因作为筛选标记的叶绿体表达载体。(3)利用基因枪法将携带有sad基因的重组质粒导入到蛋白核小球藻的叶绿体中,利用链霉素抗性对转化后的蛋白核小球藻进行了筛选,在抗性压力下完成了同质化培养。(4)对转化藻的外源基因进行了普通PCR检测,对aadA基因进行了RT-PCR检测及对sad基因荧光定量PCR检测,结果表明aadA基因、sad基因均成功整合到蛋白核小球藻的叶绿体基因组中并成功转录,而且sad基因实现了过量表达。(5)藻的油脂脂肪酸组成分析结果显示,C17:1大幅上升,提示若夫小球藻sad基因编码的酶可能具有对脂肪酸C17:0去饱和的能力;结果还显示总不饱和脂肪酸含量有所增加,提示外源sad基因表达促进了不饱和脂肪酸合成。

关键词：蛋白核小球藻叶绿体转化 sad基因不饱和脂肪酸

甘蓝型油菜Δ9硬脂酰ACP脱氢酶(sad)基因的克隆与表达分析

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中国油料作物学报 2014年第2期36卷 135-141页

作者：贾艳丽吴磊卢长明中国农业科学院油料作物研究所农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室湖北武汉430062

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（sad）核酸序列特征,检索白菜全基因组sad基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜sad基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2... 详细信息

为改良甘蓝型油菜菜籽油脂肪酸的组分,根据拟南芥Δ9硬脂酰ACP脱氢酶（sad）核酸序列特征,检索白菜全基因组sad基因和cDNA的可能序列,通过同源序列法克隆获得6个甘蓝型油菜sad基因。比对结果显示,这6个基因编码的氨基酸序列同源性达53.2%~96.3%。系统进化分析显示,甘蓝型油菜sad基因与蓖麻、大豆、芝麻、向日葵等6个油料作物sad基因的序列相似性很高,甘蓝型油菜与这些高等植物的sad基因在进化上具有较高的保守性。对4个甘蓝型油菜sad基因Bnsad1∶1、Bnsad2∶1、Bnsad2∶2和Bnsad2∶3进行了表达模式分析,发现它们在种子发育过程中表达,并且都在40d的种子中表达量达到最高值,推测这4个基因均参与了硬脂酰ACP（C18∶0-ACP）脱氢生成油酰基ACP（Δ9C18∶1-ACP）的过程,尤其是Bnsad2∶3可能为种子特异表达基因。

关键词：甘蓝型油菜 sad基因克隆表达分析

油棕9硬脂酰-ACP脱氢酶(sad)基因鉴定及表达分析

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分子植物育种 2023年

作者：周丽霞曾春茹吴秋妃曹红星杨耀东中国热带农业科学院椰子研究所海南省热带油料作物生物学重点实验室

Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶(sad)是调控油棕果实不饱和脂肪酸合成和积累的关键酶，鉴定油棕Egsad家族成员，对其理化性质及表达模式的分析对Egsad的基因功能及调控机制研究提供信息。本研究在全基因组范围内鉴定获得4个Egsad基因，Egsad1定位... 详细信息

Δ9硬脂酰-ACP脱氢酶(sad)是调控油棕果实不饱和脂肪酸合成和积累的关键酶，鉴定油棕Egsad家族成员，对其理化性质及表达模式的分析对Egsad的基因功能及调控机制研究提供信息。本研究在全基因组范围内鉴定获得4个Egsad基因，Egsad1定位在油棕2号染色体上，Egsad2定位在7号染色体上，Egsad4定位在11号染色体上，Egsad1有2个外显子，Egsad2～Egsad4有3个外显子。4个油棕Egsad蛋白均定位在细胞核，油棕Egsad1～Egsad4蛋白质大小分别为471 aa、393 aa、391 aa和399 aa，Egsad1和Egsad2的等电点分别为6.05、Egsad3和Egsad4的等电点分别为5.99和7.13，分子量分别为43.41、45.01、44.94和45.92 kD。Egsad2在油棕中果皮的4个时间点均超高量表达，其余三个基因在各组织中只有微量表达，或不表达，该结果为油棕Egsad基因调控不饱和脂肪酸合成的分子机理解析理论依据。

关键词：油棕 sad基因生物信息学表达分析

油棕^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶基因(sad)鉴定及表达分析

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分子植物育种 2024年第17期22卷 5604-5609页

作者：周丽霞曾春茹吴秋妃曹红星杨耀东中国热带农业科学院椰子研究所海南省热带油料作物生物学重点实验室文昌571339

9硬脂酰-ACP脱氢酶(sad)是调控油棕果实不饱和脂肪酸合成和积累的关键酶,鉴定油棕Egsad家族成员,对其理化性质及表达模式的分析对Egsad的基因功能及调控机制研究提供信息。本研究在全基因组范围内鉴定获得4个Egsad基因,Egsad1定位在油棕... 详细信息

9硬脂酰-ACP脱氢酶(sad)是调控油棕果实不饱和脂肪酸合成和积累的关键酶,鉴定油棕Egsad家族成员,对其理化性质及表达模式的分析对Egsad的基因功能及调控机制研究提供信息。本研究在全基因组范围内鉴定获得4个Egsad基因,Egsad1定位在油棕2号染色体上,Egsad2定位在7号染色体上,Eg sad4定位在11号染色体上,Eg sad1有2个外显子,Egsad2~Egsad4有3个外显子。4个油棕Egsad蛋白均定位在细胞核,油棕Egsad1~Egsad4蛋白质大小分别为471、393、391和399 aa,Egsad1和Eg sad2的等电点分别为6.05、Egsad3和Egsad4的等电点分别为5.99和7.13,分子量分别为43.41、45.01、44.94和45.92 kD。Egsad2在油棕中果皮的4个时间点均超高量表达,其余3个基因在各组织中只有微量表达或不表达,该结果为油棕Eg sad基因调控不饱和脂肪酸合成的分子机理解析理论依据。

关键词：油棕 sad基因生物信息学表达分析

油棕^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶Egsad基因的克隆及表达分析

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热带作物学报 2022年第2期43卷 235-243页

作者：王梦娣李睿曹红星金龙飞李新国海南大学园艺学院/海南省热带园艺作物品质调控重点实验室海南海口570228 中国热带农业科学院椰子研究所/海南省热带油料作物生物学重点实验室海南文昌571339

^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶(^(Δ)9 stearoyl-ACP dehydrogenase,sad)是植物中重要的脂肪酸脱氢酶,在调控不饱和脂肪酸合成中发挥着重要作用。本研究以非洲油棕和杂交油棕为材料,在油棕果实油脂积累期,分别测定花后120、140、160 d 3个时... 详细信息

^(Δ)9硬脂酰-ACP脱氢酶(^(Δ)9 stearoyl-ACP dehydrogenase,sad)是植物中重要的脂肪酸脱氢酶,在调控不饱和脂肪酸合成中发挥着重要作用。本研究以非洲油棕和杂交油棕为材料,在油棕果实油脂积累期,分别测定花后120、140、160 d 3个时期的脂肪酸组分;从油棕中克隆sad基因,并对其理化性质、进化关系、启动子顺式作用元件进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测sad在2个油棕品种果实成熟期的表达特征。结果表明:非洲油棕中总不饱和脂肪酸(棕榈酸和硬脂酸)比例(55.76%~60.27%)显著高于杂交油棕(37.2%~45.43%),杂交油棕中不饱和脂肪酸(油酸和亚油酸)比例(51.61%~56.92%)显著高于非洲油棕(35.54%~38.64%);鉴定了7个基因命名为:Egsad1~Egsad4和Oesad1~Oesad3;Egsad基因编码的肽链平均为413个氨基酸,分子量为43.41~45.92 kDa,等电点为5.99~7.13,蛋白不稳定指数为44.07~53.25,总平均亲水性为-0.496~-0.405。Oesad基因编码的肽链平均为405个氨基酸,分子量为44.94~49.39kDa,等电点为6.05~7.14,蛋白不稳定指数为43.44~44.61,总平均亲水性为-0.554~-0.489。多序列比对分析,油棕sad基因氨基酸序列中存在典型sad特征的保守组氨酸富集区:EENRHG和DEKRHE。在sad的启动子上鉴定出植物激素响应、逆境胁迫响应、光响应和逆境响应顺式作用元件。Egsads在油棕果实成熟过程中呈上调表达趋势,Egsad1和Egsad2在杂交油棕中表达量显著高于非洲油棕,Oesads在杂交油棕果实花后140 d中表达量最高,在杂交油棕的3个时期中均呈现先升高后下降的趋势,且在花后120 d的表达量显著高于花后120 d和160 d。本研究结果为进一步研究sad调控油棕不饱和脂肪酸合成的机制奠定基础。

关键词：油棕 sad基因脂肪酸生物信息学基因表达

木薯Mesad基因的电子克隆与生物信息学分析

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南昌大学学报（理科版） 2021年第4期45卷 377-382,393页

作者：杜尚广涂序堂熊敏余波曹文艳徐雅楠罗火林南昌师范学院生命科学学院南昌330000 南昌大学生命科学学院南昌330000

Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-acyl carrier protein delta 9-desaturase,sad)是植物响应逆境胁迫的关键酶,在响应低温胁迫中发挥着重要的作用,克隆木薯(Manihot esculenta)sad基因对抗寒机理及品种改良研究具有很大的理论意义和现实... 详细信息

Δ9-硬脂酰-ACP脱氢酶(stearoyl-acyl carrier protein delta 9-desaturase,sad)是植物响应逆境胁迫的关键酶,在响应低温胁迫中发挥着重要的作用,克隆木薯(Manihot esculenta)sad基因对抗寒机理及品种改良研究具有很大的理论意义和现实意义。本文以拟南芥(Arabidopsis thaliana)的sad同源蛋白为探针,利用电子克隆技术,得到木薯sad的cDNA,并对表达蛋白的一级至高级结构、结构域、基本理化性质及系统发育等进行生物信息学分析。结果表明,木薯sad基因cDNA长度为1685 bp,开放阅读框(ORF)为176~1366 bp,编码396个氨基酸,主要包含α螺旋以及无规则卷曲序列。该蛋白主要定位在叶绿体基质内,包含酰基-ACP脱氢酶结构域,具有酸性和亲水性。系统进化分析显示,木薯与蓖麻(Ricinus communis)、巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)和麻疯树(Jatropha curcas)等植物亲缘进化关系非常相近。本研究结果可为Mesad基因功能解析、木薯抗寒机理及耐低温品种改良等奠定基础。

关键词：木薯抗寒性 sad基因电子克隆生物信息学

与棉花脂肪酸代谢相关的三个基因家族全基因组鉴定与表达分析

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与棉花脂肪酸代谢相关的三个基因家族全基因组鉴定与表达分析

作者：丁检南京农业大学

学位级别：硕士

棉花不仅是重要的纤维,也是重要的油料作物。脂肪酸合成相关代谢在棉花种子的油分含量和组分、纤维发育,抗病抗逆等调控进程中起着重要作用。近年来棉花分子生物学研究得到长足进展,尤其是在棉花纤维的产量和品质改良的研究方面取得了... 详细信息

棉花不仅是重要的纤维,也是重要的油料作物。脂肪酸合成相关代谢在棉花种子的油分含量和组分、纤维发育,抗病抗逆等调控进程中起着重要作用。近年来棉花分子生物学研究得到长足进展,尤其是在棉花纤维的产量和品质改良的研究方面取得了较多成果,但在棉籽油的含量和组分改良的研究方面相对匮乏。本研究以最新公布的二倍体雷蒙德氏棉全基因组序列为背景,结合相关生物信息学软件和技术,分别鉴定与棉花脂肪酸代谢相关的三个基因的家族成员,并对这其进行系统进化、基因结构以及表达特征等方面分析:1、通过鉴定分别获得8个LPAT,9个sad,19个FAD基因家族成员。根据其在染色体上的位置顺序分别命名为GrLPAT1-GrLAPT8,Grsad1-Grsad9和GrFAD1-GrFAD19。系统进化分析表明棉花8个LPAT基因分为4类,分布在6条染色体上;9个sad基因分为两类,分布于5条染色体上;19个FAD基因分为两类,分布于11条染色体上。在基因结构上:所有棉花的LPAT基因都存在2个以上的内含子;sad基因的Ⅰ类除Grsad1没有内含子,其他6个基因都含有2个内含子,而Ⅱ类都含有一个内含子;FAD基因的Ⅰa类都有7个内含子,Ⅰb类基因中除了 GrEAD17和GrFAD18有内含子外,其他四个基因的编码区均无内含子的存在,Ⅱ类基因中四个有内含子,另外四个则没有内含子。这种基因结构上的多样性,可能与基因的功能有关。2、以陆地棉7235的根、茎、叶以及不同发育时期的胚珠和纤维为材料,通过荧光定量PCR技术,研究了上述基因家族成员的表达特征。表达分析发现,三个基因家族的基因表达特征都呈现多样性。其中,sad2,sad4和FAD19在不同发育时期的棉花胚珠中优势表达;8个LPAT基因均在纤维中优势表达,同时sad9、FAD3、FAD6、EAD7、FAD13以及FAD16也在纤维中优势表达。说明这些基因的表达与棉纤维发育及种子发育相关。3、分别选择棉花种子高油和低油材料对Grsad2,Grsad4和GrFAD19进行表达特征分析,发现三个基因在高油和低油棉花材料中的表达均有明显差异,尤其是在种子发育后期。进一步从高油和低油材料中克隆了三个基因的基因组序列,测序分析后发现高油和低油材料中sad4基因A亚组序列存在两处碱基的差异位点。基于该位点差异开发基因专化的SNP标记,分析含286个不同棉花品种的自然群体中该基因差异与脂肪酸含量和纤维品质等性状指标的关联,结果表明第二处差异(TT/--)与油酸,亚油酸,O/L值以及纤维的马克隆值存在显著(Psad4基因与棉花纤维和种子品质相关。

关键词：棉花脂肪酸代谢全基因组鉴定表达分析 LPAT基因 sad基因 FAD基因