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Design, synthesis and Biological Evaluation of Potent and selective s1pr1 Agonists for the Treatment of Ulcerative Colitis

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Chinese Journal of Chemistry 2022年第22期40卷 2625-2632页

作者： Huan He Mengting Xie Mengting Zhang Haiqin Zhang Huan Zhu Yuxian Fang Zihao shen Rui Wang Zhenjiang Zhao Lili Zhu Xuhong Qian Honglin Li shanghai Key Laboratory of New Drug Design School of PharmacyEast China University of Science&TechnologyShanghai 200237China Innovation Center for Al and Drug Discovery(ICAlDD) East China Normal UniversityShanghai 200062China

The binding of sphingosine-1-phosphate(s1P)with the s1pr1-5 plays a fundamental physiological role in a number of processes including vascular development and stabilization,lymphocyte migration and distribution.s1P-s1pr1 signal axis established roles in immune cell trafficking thus playing a therapeutic role in multiple sclerosis and inflammatory bowel disease.In this study,a series of oxadiazole derivatives were designed and synthesized as s1pr1 agonists based on rational drug design.Among them,compound 9i was identified as a potent and selective s1pr1 agonist with activities onβ-arrestin recruitment(EC50=0.36 nmol/L)and receptor internalization(EC50=8.09 nmol/L).Meanwhile,compound 9i displayed an oral bioavailability up to 93.6%.Based on its excellent activity to s1pr1 and pharmacokinetic properties,compound 9i effectively alleviated dextran sulfate sodium(Dss)-induced ulcerative colitis in mice at a dose of 0.1 mg/kg.

关键词： Ulcerativecolitis s1pr1 Inflammation Drugdesign structure-activity relationships

老年C57BL/6J小鼠内皮细胞上s1pr1对血迷路屏障通透性的影响

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中国细胞生物学学报 2023年第8期45卷 1141-1151页

作者：余蒙余苗孙诗恒王皓阳曾宪思刘志丹姜文君李丽浙江中医药大学基础医学院杭州310000 嘉兴学院医学院基础医学部嘉兴314000 石河子大学医学院生理教研室石河子832002

该研究通过检测不同月龄C57BL/6J小鼠血管纹上s1pr1的表达情况,进一步探究老年耳蜗血管纹内皮细胞上s1pr1变化对血迷路屏障通透性的影响。用听性脑干反应(auditory brain response,ABR)检测听觉功能;伊文思蓝染色检测耳蜗血迷路屏障的... 详细信息

该研究通过检测不同月龄C57BL/6J小鼠血管纹上s1pr1的表达情况,进一步探究老年耳蜗血管纹内皮细胞上s1pr1变化对血迷路屏障通透性的影响。用听性脑干反应(auditory brain response,ABR)检测听觉功能;伊文思蓝染色检测耳蜗血迷路屏障的通透性;免疫荧光检测耳蜗血管纹上s1pr1和紧密连接蛋白表达水平;ELIsA检测s1P的释放量;Transwell小室检测内皮细胞通透性;Western blot检测EC上s1pr1和紧密连接蛋白的表达水平。结果显示,12m组小鼠听力阈值明显增高且高频听力损失明显,耳蜗血迷路屏障通透性升高,s1pr1和紧密连接蛋白表达水平均降低。在细胞水平,D-gal+EC组中s1P的释放量降低,s1pr1表达水平下降,加入外源s1P后,s1pr1表达水平增加;D-gal+EC组紧密连接蛋白表达水平降低,内皮细胞通透性增加,加入外源s1P后,紧密连接蛋白表达水平增加,内皮细胞通透性降低,给予s1pr1抑制剂干预后,紧密连接蛋白表达水平降低,内皮细胞通透性增加。在衰老状态下,耳蜗血管纹内皮细胞上s1pr1表达下降,这可能会下调紧密连接蛋白的表达,进而影响血迷路屏障通透性。

关键词：衰老 s1pr1 紧密连接蛋白血迷路屏障老年性聋

Ero-1α通过介导s1pr1/sTAT3/VEGF-A对胶质瘤增殖与侵袭的影响

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Ero-1α通过介导S1PR1/STAT3/VEGF-A对胶质瘤增殖与侵袭的影响

作者：石禹苏州大学

学位级别：硕士

目的:一、依据生物信息学方法,挖掘内质网氧化酶1α(Endoplasmic reticulum oxidoreductin-1α,Ero-1α)对胶质瘤患者的潜在影响。二、研究Ero-1α在胶质瘤中的表达以及对胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响。三、探索Ero-1α通过介导s1pr1/sTA... 详细信息

目的:一、依据生物信息学方法,挖掘内质网氧化酶1α(Endoplasmic reticulum oxidoreductin-1α,Ero-1α)对胶质瘤患者的潜在影响。二、研究Ero-1α在胶质瘤中的表达以及对胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响。三、探索Ero-1α通过介导s1pr1/sTAT3/VEGF-A在胶质瘤增殖与侵袭中的作用。方法:本研究设计分三部分实施。第一部分基于生物信息学分析,利用TCGA数据库搜集胶质瘤患者mRNA测序数据,使用R limma包、ggpubr包、survminer包、survival包等软件包,挖掘Ero-1α在胶质瘤中的表达水平,对胶质瘤患者的影响及与肿瘤恶性度的关系。第二部分探究Ero-1α在胶质瘤中的表达和对胶质瘤细胞增殖与侵袭的影响。通过WB、PCR检测人胶质瘤与瘤周正常组织的Ero-1α相对表达水平,WB、PCR检测不同人胶质瘤细胞(T-98、U87、251)和正常神经元细胞的表达水平。然后选取前期实验中相对表达Ero-1α蛋白水平较高的胶质瘤细胞系T-98,建立慢病毒稳定转染的Ero-1α过表达及沉默的相应胶质瘤细胞系T-98。共分为五组,分别为空白组,过表达载体组,Ero-1α过表达组,敲低载体组,Ero-1α敲低组。运用Transwell、划痕实验、CCK8检测细胞增殖、侵袭能力变化;WB检测不同组胶质瘤细胞EMT表达水平(E-cadherin、N-cadherin、MMP2、Vimentin)。验证 Ero-1α 对胶质瘤增殖与侵袭的影响。第三部分探究在胶质瘤增殖与侵袭中Ero-1α与s1pr1/sTAT3/VEGF-A通路的联系。先分为四组,分别为过表达载体组,Ero-1α过表达组,敲低载体组,Ero-1α敲低组。WB检测四个组VEGF-A表达水平。后用免疫荧光检测Ero-1α与s1pr1的表达位置,验证Ero-1α与s1pr1的表达关系;运用WB检测Ero-1α、s1pr1、sTAT3、psTAT3的表达水平。慢病毒转染胶质瘤细胞T-98使Ero-1α过表达,应用抑制剂抑制s1pr1表达。在验证s1pr1成功抑制的前提下,分为Ero-1α过表达组及Ero-1α过表达+应用s1pr1抑制剂组。运用Transwell、划痕实验分别检测胶质瘤细胞增殖与侵袭能力;WB检测sTAT3、psTAT3、VEGF-A表达水平。验证Ero-1α是否通过介导s1pr1/sTAT3/VEGF-A对胶质瘤的增殖与侵袭产生作用。结果:一、生物信息学分析显示Ero-1α在胶质瘤患者肿瘤组织中的表达高于正常脑组织,Ero-1α表达水平升高与年龄、肿瘤病理分期等因素有关。与Ero-1α低表达组相比,Ero-1α高表达组的总生存期和肿瘤无进展生存期显著缩短。单因素Cox回归分析与多因素Cox回归分析对每个变量逐个进行分析证实Ero-1α是GBM预后的独立预测因子。Ero-1α在胶质母细胞瘤中表达增强,且与肿瘤增殖标志物Ki67相关。二、WB、PCR结果表明胶质瘤组织中Ero-1α的表达水平高于瘤周组织,胶质瘤细胞中Ero-1α的表达水平高于正常神经元细胞。Ero-1α过表达的胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力明显增强。Transwell、划痕实验、CCK8等实验提示过表达Ero-1α后胶质瘤细胞的增殖与侵袭能力增强,WB结果提示E-cadherin表达减少,N-cadherin、波形蛋白、MMP2表达增强,敲低Ero-1α则具有相反作用。三、免疫荧光结果提示Ero-1α与s1pr1共定位于细胞质中,且过表达Ero-1α可明显提高s1pr1的表达水平,WB检测结果提示过表达Ero-1α后s1pr1、sTAT3、psTAT3、VEGF-A的表达水平提高,敲低Ero-1α则具有相反作用。应用s1pr1抑制剂后,Transwell、划痕实验提示胶质瘤细胞增殖与侵袭能力减弱,WB检测结果提示s1pr1、sTAT3、psTAT3、VEGF-A 表达减少。结论:一、Ero-1α在胶质瘤组织中的表达高于正常组织,可作为临床胶质瘤患者的潜在预后独立预测因子和治疗靶点。二、Ero-1α表达水平在胶质瘤中高于正常组织。Ero-1α表达量增加可提高VEGF-A表达量,促进胶质瘤血管生成。三、Ero-1α可通过介导s1pr1/sTAT3/VEGF-A途径,增强胶质瘤的增殖与侵袭能力,促进肿瘤血管生成,下调Ero-1α可降低胶质瘤的增殖与侵袭能力。因此,本实验为胶质瘤的靶向治疗提供了一种新思路。

关键词： Ero-1α 胶质瘤 s1pr1 VEGF-A 增殖与侵袭

s1P/s1pr1对大鼠心肌梗死边缘区血管新生的影响及其机制研究

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S1P/S1PR1对大鼠心肌梗死边缘区血管新生的影响及其机制研究

作者：雷偲南华大学

学位级别：硕士

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是指由各种因素引起的冠状动脉堵塞导致心肌组织因缺血缺氧而坏死。经过长时间的发展,缺血区域的心肌组织转化为纤维瘢痕组织,最终引发心力衰竭。促进心肌梗死边缘区血管新生可以通过减小心肌纤维化... 详细信息

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)是指由各种因素引起的冠状动脉堵塞导致心肌组织因缺血缺氧而坏死。经过长时间的发展,缺血区域的心肌组织转化为纤维瘢痕组织,最终引发心力衰竭。促进心肌梗死边缘区血管新生可以通过减小心肌纤维化的面积改善心脏功能。1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,s1P)是一种具有生物活性的脂质,通过结合并激活其受体s1pr1(s1P Receptor 1,s1pr1)促进血管新生,但s1P/s1pr1对心肌梗死的影响及其作用机制仍不明确。腺病毒基因Bcl-2同源蛋白(B-cell leukemia/lymphoma2/adenovirus E1B interacting protein 3-like,BNIP3L)是一种线粒体外膜蛋白,通过介导线粒体自噬减轻组织的缺血性损伤。本研究证明s1P/s1pr1通过促进BNIP3L介导的线粒体自噬降低内皮细胞中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROs)的水平,进而促进心肌梗死边缘区血管新生,改善心脏功能。第一部分s1pr1激动剂对心肌梗死大鼠的影响目的:建立大鼠心肌梗死模型,观察s1pr1激动剂对心肌梗死大鼠的影响。方法:将sD大鼠随机分为sham组、MI组和MI+sEW2871组,使用s1pr1激动剂sEW2871处理MI+sEW2871组大鼠4周。通过超声心动图检测大鼠心脏功能;免疫组织化学染色检测s1pr1的表达;大鼠心脏取材,拍照观察各组大鼠心脏的整体情况;通过TTC染色、Masson染色和HE染色观察心肌梗死的面积和纤维化程度;分别使用免疫组织化学染色和免疫组织荧光染色的方法检测心肌梗死边缘区VEGF、CD31和BNIP3L的表达情况。结果:超声心动图检测显示s1pr1激动剂改善大鼠心肌梗死后的心脏功能;免疫组织化学结果显示s1pr1激动剂促进大鼠心肌梗死边缘区s1pr1的表达;大鼠心脏整体图显示:sham组心脏无明显异常,MI组心脏心肌梗死区的室壁向外膨出形成室壁瘤,MI+sEW2871组心脏心肌梗死区的室壁未见明显向外膨出;TTC染色、Masson染色和HE染色结果表明s1pr1激动剂减小心肌梗死面积和心肌纤维化面积;免疫组织化学和免疫荧光结果显示s1pr1激动剂促进大鼠心肌梗死边缘区的组织中VEGF、CD31和BNIP3L的表达,且CD31和BNIP3L共定位。小结:在大鼠心肌梗死模型中,s1pr1激动剂上调BNIP3L的表达水平,促进心肌梗死边缘区血管新生,减小心肌纤维化面积,改善心脏功能。第二部分s1P/s1pr1通过上调BNIP3L介导的线粒体自噬促进HUVECs迁移和管形成目的:探究s1P/s1pr1对缺氧环境下HUVECs迁移和管形成的影响及其机制。方法:将HUVECs分为Control组和Hypoxia组,通过基质胶实验观察低氧处理对HUVECs管形成的影响;通过透射电镜观察低氧处理后HUVECs的线粒体自噬情况;通过Western blot检测BNIP3L、自噬底物P62和自噬相关蛋白LC3的含量。使用s1P和s1pr1激动剂sEW2871处理低氧环境下的HUVECs,将HUVECs分为Control组、Hypoxia组、Hypoxia+s1P组、Hypoxia+sEW2871组和Hypoxia+s1P+sEW2871组,通过Western blot检测BNIP3L、P62和LC3的表达情况。将HUVECs分为Control组、Hypoxia组、Hypoxia+s1P组、Hypoxia+s1P+sEW2871组和Hypoxia+s1P+sEW2871+氯喹(Chloroquine,CQ)组,观察用CQ阻断线粒体自噬对HUVECs的ROs水平、细胞迁移和管形成的影响。结果:低氧促进HUVECs管形成及BNIP3L介导的线粒体自噬;在低氧环境下,s1P/s1pr1促进HUVECs中BNIP3L和自噬相关蛋白的表达;s1P/s1pr1促进低氧诱导的HUVECs迁移和管形成;在缺氧环境中,s1P/s1pr1降低HUVECs的ROs水平,使用CQ阻断线粒体自噬可以抑制s1P/s1pr1降低HUVECs中ROs水平的作用。小结:低氧激活BNIP3L介导的线粒体自噬并诱导HUVECs管形成。此外,在低氧环境下,s1P/s1pr1通过上调BNIP3L介导的线粒体自噬降低HUVECs的ROs水平,进而促进HUVECs迁移和管形成。结论1.s1pr1激动剂通过促进心肌梗死边缘区的血管新生改善心脏功能。2.在低氧环境下,s1P/s1pr1通过上调BNIP3L介导的线粒体自噬降低ROs水平,进而促进HUVECs迁移和管形成。

关键词： s1P s1pr1 BNIP3L 线粒体自噬血管新生

MiR-423-5p靶向s1pr1负向调控内皮细胞增殖和迁移的机制研究

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MiR-423-5p靶向S1PR1负向调控内皮细胞增殖和迁移的机制研究

作者：仇湘辉南华大学

学位级别：硕士

目的:探究miR-423-5p在内皮细胞增殖和迁移中的作用及分子机制。方法:1.分别转染agomiR-423-5p、antagomiR-423-5p及其阴性对照进入人脐静脉内皮细胞内。采用EDU、Western-blot实验检测内皮细胞增殖相关蛋白CD105(Endoglin)表达、划痕... 详细信息

目的:探究miR-423-5p在内皮细胞增殖和迁移中的作用及分子机制。方法:1.分别转染agomiR-423-5p、antagomiR-423-5p及其阴性对照进入人脐静脉内皮细胞内。采用EDU、Western-blot实验检测内皮细胞增殖相关蛋白CD105(Endoglin)表达、划痕实验、Transwell实验观察miR-423-5p对内皮细胞增殖和迁移的影响;2.通过生物信息学工具(http://***)预测miR-423-5p的靶基因为s1pr1。采用双荧光素酶基因报告实验验证miR-423-5p 与 s1pr1(sphingosine 1-phosphate receptor 1)的 3’UTR(3’非翻译区)的相互作用。采用Western-blot实验分析s1pr1及其下游蛋白 eNOs(endothelial nitric oxide synthase)的表达情况;3.在人脐静脉内皮细胞内通过共转染的方法同时敲低miR-423-5p及其靶基因s1pr1,通过挽救实验(rescue)策略进行增殖和迁移表型实验以揭示s1pr1介导的生物学作用。结果:1.EDU实验检测细胞的增殖活性,结果显示:高表达miR-423-5p明显抑制细胞的增殖能力,低表达miR-423-5p明显促进细胞的增殖能力。Western-blot免疫印迹实验结果显示,过表达miR-423-5p后CD105蛋白的表达明显下降,而低表达miR-423-5p后CD105蛋白的表达明显增加。划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移能力,划痕实验结果显示,在划痕24h后,与对照组相比,高表达miR-423-5p组的细胞迁移数目明显减少,而低表达miR-423-5p组的细胞迁移数目明显增加。Transwell实验结果显示,与对照组相比,高表达miR-423-5p组的细胞在48h内穿透聚碳酸脂膜的细胞数量明显减少,而低表达miR-423-5p组的细胞在48h内穿透聚碳酸脂膜的细胞数量显著增加,提示miR-423-5p能明显抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。2.运用Targetscan软件推测出s1pr1是miR-423-5p的下游预测靶基因。双荧光素酶报告实验结果显示,过表达miR-423-5p显著抑制了与s1pr1野生型3’UTR融合的荧光素酶活性(P1),提示miR-423-5p可以直接与s1pr1的3’UTR结合并调节其表达。Western-blot免疫印迹实验结果显示,过表达miR-423-5p后s1pr1和eNOs蛋白的表达明显下降,而低表达miR-423-5p后s1pr1和eNOs蛋白的表达明显增加。3.Western-blot免疫印迹实验结果显示,低表达miR-423-5p能够上调s1pr1的表达,而同时低表达miR-423-5p和s1pr1能够显著降低s1pr1蛋白的表达,提示共转染效率较好。EDU实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和s1pr1组Edu阳性细胞的比例(绿色)显著减少了,提示低表达s1pr1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞增殖的能力。Western-blot免疫印迹实验结果显示,低表达miR-423-5p能够上调CD105蛋白的表达,而同时低表达miR-423-5p和s1pr1能够显著降低CD105蛋白的表达。划痕实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和s1pr1组细胞迁移数量明显减少,提示低表达s1pr1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞迁移的能力。Transwell实验结果显示,与低表达miR-423-5p组相比,双敲miR-423-5p和s1pr1组细胞穿透聚碳酸脂膜的细胞数量明显减少,同样提示低表达s1pr1能够消除低表达miR-423-5p促进细胞迁移的能力。结论:miR-423-5p通过靶向s1pr1/eNOs信号通路抑制内皮细胞的增殖和迁移。

关键词： miR-423-5p s1pr1 增殖迁移 eNOs

三阴性乳腺癌患者中s1pr1、Caspase-3的表达及其与病理特征的关系分析

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临床医学工程 2023年第6期30卷 867-868页

作者：范学亮王中山王春锋郑州金域临床检验中心病理科河南郑州450016

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)患者中s1pr1、Caspase-3的表达及其与病理特征的关系。方法回顾性分析76例乳腺癌患者的病历资料,其中TNBC患者20例(TNBC组),非TNBC患者56例(非TNBC组)。采用免疫组化法检测两组乳腺癌标本中的s1pr1、Caspase-... 详细信息

目的探讨三阴性乳腺癌(TNBC)患者中s1pr1、Caspase-3的表达及其与病理特征的关系。方法回顾性分析76例乳腺癌患者的病历资料,其中TNBC患者20例(TNBC组),非TNBC患者56例(非TNBC组)。采用免疫组化法检测两组乳腺癌标本中的s1pr1、Caspase-3表达,分析二者阳性表达与TNBC病理特征的关系。结果TNBC组标本中s1pr1、Caspase-3的阳性表达率高于非TNBC组(Ps1pr1、Caspase-3表达存在显著差异(Ps1pr1、Caspase-3在TNBC患者中表达升高,且二者的表达与淋巴结转移情况、TNM分期具有密切联系。

关键词：三阴性乳腺癌 s1pr1 Caspase-3 病理特征

s1pr1在乳腺癌微血管生成模式中的调控机制研究

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S1PR1在乳腺癌微血管生成模式中的调控机制研究

作者：刘爽天津医科大学

学位级别：硕士

研究目的:在全球女性患者中,乳腺癌是最常诊断的肿瘤,其死亡率也非常高,这与乳腺癌丰富的血管生成密不可分。肿瘤的血管生成模式大体可以分为两种:内皮依赖性血管和肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry)。肿瘤血管生成拟态是指由肿... 详细信息

研究目的:在全球女性患者中,乳腺癌是最常诊断的肿瘤,其死亡率也非常高,这与乳腺癌丰富的血管生成密不可分。肿瘤的血管生成模式大体可以分为两种:内皮依赖性血管和肿瘤血管生成拟态(vasculogenic mimicry)。肿瘤血管生成拟态是指由肿瘤细胞维成管道为自己提供能量的方式,这些肿瘤细胞同时具有肿瘤细胞和内皮细胞的标志物。在很多肿瘤中证实,由于血管生成拟态的出现,导致病人不良预后。磷酸鞘氨醇受体1(s1pr1)是一种含有382个氨基酸的蛋白质,在血管生成与淋巴转移中起到非常重要的作用。但是其在肿瘤血管生成中的研究很少,尤其是对肿瘤血管生成拟态(VM)中的作用更不明确。本研究探讨s1pr1在乳腺癌的血管生成模式中起到的调控作用,进一步阐明s1pr1对人乳腺癌中两种血管生成模式转换的作用机制,为乳腺癌的抗血管生成治疗提供新思路。研究方法:1.100例由两名资深病理医师确认诊断的乳腺癌病例及其组织标本,标本由天津医科大学总医院提供。通过免疫组织化学染色分析s1pr1在人体组织中的表达情况,进一步分析s1pr1的表达与临床病例资料中的病理学分期、分级、淋巴转移的关系。CD31/PAs双重染色法统计s1pr1的表达与VM及内皮依赖性血管的相关性。采用Kaplan-Meier法,进行生存分析。2.免疫组织化学染色法对100例乳腺癌组织中VE-cadherin、β-Catenin的表达进行检测,通过Pearson统计学方法分析s1pr1与VE-cadherin、β-Catenin的表达差异及其相关性。3.通过Western blot法,在乳腺癌细胞系中(MDA-MB-231、Hs-578T、BT-474、MCF-7、T-47D)筛选出s1pr1本底高表达和低表达的细胞系,并用慢病毒转染法对s1pr1的表达进行干扰或过表达。用嘌呤霉素筛选出s1pr1乳腺癌稳转细胞系。4.通过三维培养观察内皮细胞与乳腺癌细胞共培养后的成管能力及乳腺癌细胞自身成管能力在各组间的差异。用MTT法检测内皮细胞与乳腺癌细胞共培养后各组内皮细胞的增殖活性情况。通过侵袭迁移、划痕实验观察s1pr1对乳腺癌细胞侵袭迁移及愈合能力的影响。5.在s1pr1转染后的乳腺癌细胞中,进行Western blot和免疫荧光实验,观察VE-cadherin、β-Catenin、EphA2的表达情况。6.通过Western blot实验检测s1pr1上下调之后VE-cadherin(Y731)位点磷酸化的改变,并用酶联免疫吸附试验(Elisa)检测其下游因子VEGF的表达情况。7.检测s1pr1转染过的乳腺癌细胞中RhoA的活性。加入RhoA抑制剂,并通过Western blot,三维培养及免疫荧光检测RhoA活性被抑制后,VE-cadherin(Y731)、VE-cadherin、β-Catenin的表达变化及成管情况。Elisa检测RhoA活性被抑制后的VEGF分泌情况。在加入s1pr1抑制剂后,再检测RhoA活性,以及下游因子表达情况。8.s1pr1稳转后的人乳腺癌细胞注射到裸鼠皮下,对肿瘤体积变化进行测量,并绘制肿瘤体积生长曲线。通过免疫组织化学染色及Endomucin/PAs双重染色检测肿瘤中s1pr1、VE-cadherin、β-catenin的表达情况,及内皮依赖性血管和VM的数量。研究结果1.在100例人乳腺癌组织中,63例(63/100)s1pr1高表达,其与肿瘤的分级(p=0.027)、转移(p=0.019)及VM(p=0.004)相关。Kaplan-Meier法分析得出,在非三阴乳腺癌中s1pr1的高表达与不良预后相关,而在三阴乳腺癌中没有显著差异。2.Pearson卡方检验显示s1pr1与VE-cadherin、β-Catenin的表达具有相关性,并且通过Pearson相关性分析得出s1pr1与VE-cadherin的表达负相关,s1pr1与β-Catenin的表达正相关(ps-578T、BT-474、MCF-7、T-47D)经过Western blot验证,挑选出s1pr1高表达的细胞系MCF-7,s1pr1低表达的细胞系MDA-MB-231。随后分别转入s1pr1的小干扰RNA和cDNA到MCF-7,MDA-MB-231细胞系,经过Western blot检测挑选出两个最佳的下调和一个上调。4.乳腺癌细胞系MCF-7下调s1pr1后,细胞的侵袭、迁移及管道形成均增强(ps1pr1后,细胞的侵袭、迁移及管道形成均减弱(ps1pr1组的内皮细胞细胞活性和成管能力都降低(ps1pr1组的内皮细胞细胞活性和成管能力都增强(ps1

关键词：乳腺癌血管生成拟态内皮依赖性血管 s1pr1 VE-cadherin

蛛网膜下腔出血大鼠模型早期脑损伤中s1pr1的表达及依达拉奉干预后的影响研究

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蛛网膜下腔出血大鼠模型早期脑损伤中S1PR1的表达及依达拉奉干预...

作者：朱清风湖南师范大学

学位级别：硕士

目的:本实验采用sD(sprague dawley)蛛网膜下腔出血大鼠模型,并从形态学水平、分子水平和药物干预等方面进行实验,采用HE染色、WB、reat-time PCR等方法,观察蛛网膜下腔出血早期脑损伤大鼠脑组织中s1pr1(sphingosine-1-Phosphate Recept... 详细信息

目的:本实验采用sD(sprague dawley)蛛网膜下腔出血大鼠模型,并从形态学水平、分子水平和药物干预等方面进行实验,采用HE染色、WB、reat-time PCR等方法,观察蛛网膜下腔出血早期脑损伤大鼠脑组织中s1pr1(sphingosine-1-Phosphate Receptor 1,s1pr1)和炎症因子TNF-α的表达情况。初步研究并讨论依达拉奉对s1pr1的表达变化的作用和对蛛网膜下腔出血早期脑损伤的影响。方法:实验选用的是70只等级属于清洁级、体格较为健康、性情相对危险的雄性sprague-Dawley大鼠,年龄范围控制在周龄102之间,体重控制在250g以上,300g以下的范围内。然后基于随机分组的方法理论,把上述大鼠分为数量为10只不作处理的空白参照组,数量为20只假定做了手术的假手术组,蛛网膜下腔出血早期脑损伤组(n=20)和药物干预组(n=20)四个组,这四组为了方便实验操作,分别编号为第1至4组。采用视交叉前池注血法建立蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,sAH)后早期脑损伤(Early Brain Injury,EBI)动物模型,造模后对药物干预组大鼠采用依达拉奉进行药物干预。造模成功24h后,采用动物行为学评分法来评价sD大鼠的神经功能缺损情况,并对各组大鼠的神经功能缺损评分进行比较。采用HE染色观察大鼠脑组织的病理形态,观察各组大鼠神经元坏死情况,评估各组大鼠的脑组织损伤程度。采用Western Blot的方法检测各组大鼠脑组织中s1pr1蛋白和TNF-α的表达情况,并对各大鼠脑组织中s1pr1蛋白和TNF-α的表达情况进行比较。采用real-time PCR的方法检测各组大鼠脑组织中s1pr1mRNA的定量表达情况,并根据各组大鼠脑组织中s1pr1mRNA的定量表达情况的显示结果,对数据经过处理,再分析对比。结果:1.根据显示的结果,在神经功能的完善性能方面,对各组实验进行评价:其中第一组和第二组在神经性能是否完善方面的结果一样,都为0分,蛛网膜下腔出血早期脑损伤组和在药物作用下进行试验的组即第三组和第四组,其得到的结果中,最低评分0分以及最高的评分4分都不成规律的出现,需要用同等条件下的大鼠进行补充替换,试验中出现最高和最低评分的大鼠,到最后整个评价系统完成时,第四组大鼠的神经功能缺损评分显著低于蛛网膜下腔出血早期脑损伤组,根据结果表现出的差异性,说明实验数据在统计学范畴内很有意义(Pstern Blot检测结果:蛛网膜下腔出血早期脑损伤组s1pr1的表达显著低于假手术组和正常对照组(Ps1pr1的表达显著高于假手术组和正常对照组(Ps1pr1(CD363)-mRNA在药物干预有明显表达,蛛网膜下腔出血早期脑损伤组s1pr1(CD363)-mRNA表达量与药物干预组相比则减弱,各组之间相比较均有显著的差异性(P1.蛛网膜下腔出血早期脑损伤sD大鼠脑组织中s1pr1蛋白表达降低。2.依达拉奉可以促进蛛网膜下腔出血早期脑损伤sD大鼠脑组织中s1pr1蛋白的表达,可以起到减轻炎症反应,对蛛网膜下腔出血早期脑损伤大鼠的脑起到保护作用。

关键词：蛛网膜下腔出血早期脑损伤 s1pr1 依达拉奉

KLF2对类中性粒细胞s1pr1与L-selectin启动子活性的影响

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KLF2对类中性粒细胞S1PR1与L-selectin启动子活性的影响

作者：莫磊南华大学

学位级别：硕士

目的:研究KLF2对类中性粒细胞s1pr1与L-selectin启动子活性的影响。方法:1、空载及KLF2质粒转染293T细胞,分别使用PCR、WB检测空白组、空载组、过表达组KLF2 m RNA与蛋白水平的表达变化;2、将KLF2质粒与s1pr1、L-selectin启动子报告质... 详细信息

目的:研究KLF2对类中性粒细胞s1pr1与L-selectin启动子活性的影响。方法:1、空载及KLF2质粒转染293T细胞,分别使用PCR、WB检测空白组、空载组、过表达组KLF2 m RNA与蛋白水平的表达变化;2、将KLF2质粒与s1pr1、L-selectin启动子报告质粒共转染至293T细胞中,利用双荧光素酶报告基因技术,检测KLF2对s1pr1、L-selectin启动子活性的影响;3、使用1.3%二甲基亚砜（DMsO）诱导HL-60细胞分化为类中性粒细胞（d HL-60）,通过CHIP实验检测KLF2与s1pr1、L-selectin的启动子区域结合情况。结果:1、质粒瞬时转染293T细胞48小时后,通过荧光显微镜观测空载组、空白组、过表达组的荧光,并计算出转染效率为80%;通过RT-PCR、Westernblot检测KLF2 m RNA及蛋白表达量,结果显示过表达组KLF2的m RNA及蛋白表达较对照组显著增加,差异具有统计学意义（P＜0.01）。实验表明成功构建KLF2质粒进行后续实验。2、将L-selectin、s1pr1启动子报告基因质粒与KLF2质粒共同或分别转染293T细胞时,发现实验组较对照组中KLF2质粒能显著提高s1pr1、L-selectin启动子活性,差异具有统计学意义（P＜0.01）。3、使用1.3%DMsO诱导HL-60细胞分化为类中性粒细胞,CHIP实验结果显示,KLF2与s1pr1启动子核心区（+75bp,-44bp）及L-selectin启动子核心区（-262bp,-377bp）结合。结论:类中性粒细胞KLF2可上调L-selectin、s1pr1启动子活性,并能结合s1pr1启动子核心区（+75bp,-44bp）及L-selectin启动子核心区（-262bp,-377bp）。

关键词：类中性粒细胞启动子 KLF2 s1pr1 L-selectin