检索结果-南通市图书馆

中国农业科学 2017年第15期50卷 2936-2945页

作者：潘琪刘旭旭彭浩然蒲运丹张永至叶思涵吴根土青玲孙现超西南大学植物保护学院

【目的】克隆获得番茄 syta (s.lanum lycopersicum syta，s.l syta),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确s.l syta亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病... 详细信息

【目的】克隆获得番茄 syta (s.lanum lycopersicum syta，s.l syta),分析其基因序列生物信息学特征和预测蛋白的结构特征,明确s.l syta亚细胞定位和组织表达,并分析其在绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)标记的烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)侵染下的表达变化及其对TMV移动的影响,为明确s.l syta在植物病毒侵染致病过程中的作用提供理论依据。【方法】根据番茄基因组含有的syta同源基因序列,利用Primer Premier 5.0软件设计克隆引物,采用RT-PCR技术克隆s.l syta全长序列;应用生物信息学方法分析该基因的序列特征;使用MEGA 7.0对s.l syta蛋白序列及其同源序列进行多序列比对,并构建同源物种间系统进化树;通过与GFP蛋白融合进行亚细胞定位;利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测番茄各部位s.l syta的表达量以及在TMV胁迫的番茄中s.l syta的表达变化;构建植物瞬时表达载体p CV-syta-m GFP,通过农杆菌介导在本氏烟草中瞬时表达,TMV-GFP攻毒,利用酶联免疫吸附实验(ElIsA)检测在本氏烟中瞬时表达s.l syta时TMV-GFP的积累和移动情况。【结果】克隆得到1 620 bp的s.l syta基因开放阅读框全长,序列比对及生物信息学分析表明,其编码的氨基酸序列具有sYTs家族的典型特征,含有N端的跨膜区、胞间连接区和C端的两个C2结构域;多序列对比及系统进化树分析发现,与茄科林生烟草、绒毛状烟草等植物亲缘关系较近,与黄瓜较远;亚细胞定位显示s.l syta定位于细胞质膜。在番茄的根、茎和叶中s.l syta的表达量从高到低依次为根>叶>茎;TMV-GFP侵染番茄导致其s.l syta表达量在接种后第1天显著上调,在第7天降至正常水平。在s.l syta瞬时表达的本氏烟叶片部位接种TMV-GFP,TMV-GFP在接种第5天时已经到达新叶,而接种部位仅表达空载体对照的本氏烟新叶中未观察到TMV-GFP,且接种第5天时TMV-GFP在接种叶和新叶中的积累量均明显高于其在空载体对照处理的叶片。【结论】获得的s.l syta具有sYTs家族的典型特征。s.l syta定位于细胞质膜,s.l syta在番茄根中表达量最高。在TMV-GFP胁迫下,番茄中s.l syta表达呈现先上升后下降至正常水平。在本氏烟中瞬时表达s.l syta有利于TMV-GFP侵染初期的积累和移动。

关键词：番茄 s.l syta 克隆表达分析 TMV-GFP

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番茄syta与FdⅠ及DCl相互作用及影响通路分析

番茄SYTA与FdⅠ及DCL相互作用及影响通路分析

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作者：罗可西南大学

学位级别：硕士

番茄(s.lanum lycopersicum)作为一年或多年生茄科草本植物,营养价值十分丰富,在我国种植广泛。在番茄生产上,病毒病是为害较为严重的病害之一,发病后防治困难,且易造成巨大的经济损失。目前可侵染番茄的种类病毒较多,主要包括:番茄花... 详细信息

番茄(s.lanum lycopersicum)作为一年或多年生茄科草本植物,营养价值十分丰富,在我国种植广泛。在番茄生产上,病毒病是为害较为严重的病害之一,发病后防治困难,且易造成巨大的经济损失。目前可侵染番茄的种类病毒较多,主要包括:番茄花叶病毒(tomato mosaic virus,To MV),烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus,TMV),黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,CMV),番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYlCV)等。synaptotagmin是一种膜转运蛋白,广泛存在于内分泌及神经细胞上。它是囊泡细胞融合过程中的Ca感受器,在蛋白质及膜转运过程扮演着重要的作用,并且在植物拟南芥中发现了该家族的6种亚型,命名为syta–F,同时有文献报道其在病毒侵入植物细胞的过程中扮演着重要作用。本实验室前期研究结果表明,通过酵母双杂交实验证明了s.l syta与Fd I以及DCl存在互作关系,同时在s.l syta异源过表达转基因本氏烟中,发现s.l syta与Fd I以及DCl在表达量上呈现一定的规律,本实验将继续围绕三者间蛋白的互作以及表达影响进行下一步探究实验。本文根据s.l syta设计序列引物,通过分析s.l syta蛋白二级结构特征,构建缺失突变体,利用双分子荧光互补技术(Bimolecular Fluorescent Complimentary,Bi FC),分析各蛋白互作区域和位点,构建不同荧光蛋白标记的融合蛋白植物表达载体,共表达分析各蛋白的共定位情况,并分析各蛋白共表达时的相互影响情况。探究表明验证s.l syta与Fd I和DCl均存在相互作用关系,在共聚焦显微镜下均可观察到黄色荧光。构建的缺失突变体p CV-c YFP-C2A与p CV-n YFP-Fd I、p CV-n YFP-DCl相互作用并发出黄色荧光,而p CV-c YFP-C2B与p CV-n YFP-Fd I、p CV-n YFP-DCl不发出黄色荧光,认为其C2A为s.l syta所主要行使功能的结构域,C2B在s.l syta蛋白互作中不行使功能。同时通过亚细胞共定位实验可以观察到,s.l syta对于Fd I的表达有一定的抑制作用,共表达下很难观察到Fd I发出的荧光,而s.l syta对于DCl的表达有相互促进的作用,这与本实验室前期研究结果达成一致,说明s.l syta可以通过调节相互作用的蛋白,从而达到促进病毒侵染移动的目的。为明确基因s.l syta对番茄Fd I、DCl表达及TMV侵染的影响,我们通过病毒TRV介导的沉默载体TRV:s.l syta、TRV:Fd I、TRV:DCl,在Micro-Tom番茄植株中进行基因沉默实验,注射14天后,观察表型并采集叶片提取RNA,实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测s.l syta、Fd I、DCl相对表达量,q PCR检测结果表明与对照组相比,处理组s.l syta被沉默,差异达到显著水平,Fd I的表达量与对照组相比呈现上升趋势,并且达到显著水平,与s.l syta呈现负相关,DCl的表达量与对照组相比呈现下降趋势,并且达到显著差异水平,与s.l syta呈现正相关趋势,与s.l syta异源过表达转基因本氏烟中的处理结果一致,表明s.l syta的基因的表达量对Fd I与DCl有着密切联系。为探求s.l syta可能参与的植物防御信号途径,我们对s.l syta转基因本氏烟进行了转录组测序,并进行了数据分析,分别从植物病原体互作通路以及植物MAPK(Mitogen-activated protein kinase)信号通路途径中筛选到两个抗病的重要相关基因WRKY 43以及TMV resistance N-like,认为其在病毒侵染植物的过程中具有潜在的重要作用,通过病毒介导的沉默载体TRV:WRKY43和TRV:TMV resistance N-like对本氏烟进行基因沉默,基因沉默后的本氏烟接种TMV后第3、5、7天用手持UV等观察荧光移动情况,观察结果显示,WRKY43基因沉默植株相较于对照组,TMV-GFP在第3天没有表现出明显差异,在第5天和第7天,可以看到略快于对照组,表明WRKY43基因在抗病方面有一定的抑制作用,而TMV resistance N-like基因沉默植株相较于对照组在3天没有明显差异,在第5天和第7天可以看出明显快于对照组,表明该基因在抗病方面的效果较为明显。

关键词： s.l syta FdⅠ DCl 蛋白互作 TMV

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