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汉坦病毒s片段标准品构建及在荧光定量PCR检测中的应用

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环境与职业医学 2007年第2期24卷 147-149页

作者：周欣李燕婷瞿涤复旦大学上海医学院生物医学研究院&病原微生物研究所医学分子病毒学教育部和卫生部重点实验室上海200032 上海市疾病预防控制中心上海200336

[目的]构建汉坦病毒s片段标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法检测汉坦病毒核酸。[方法]对76-118株的s片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后... 详细信息

[目的]构建汉坦病毒s片段标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法检测汉坦病毒核酸。[方法]对76-118株的s片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5a,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。在s片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时检测。[结果]该方法制备的质粒标准品应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR检测急性期病人病毒含量,具有高特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,重复性好,并能对病毒准确定量。[结论]汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;汉坦病毒s片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原。

关键词：荧光定量PcR 标准品 TaqMan针 s片段汉坦病毒

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汉坦病毒K24株M和s片段基因的结构特征

中国病毒学 2001年第4期16卷 309-314页

作者：姚智慧董关木俞永新中国药品物生制品检定所北京100050

为研究汉坦病毒K2 4株M和s片段基因的结构特征 ,从病毒感染细胞提取细胞总RNA ,经 35个循环的一次性PCR得到了与理论值相符合产物 ,将RT -PCR产物直接克隆T载体 ,经K2 4毒株M片段的全基因序列共 36 5 3个核苷酸 ,四种核苷酸的酶切和PCR... 详细信息

为研究汉坦病毒K2 4株M和s片段基因的结构特征 ,从病毒感染细胞提取细胞总RNA ,经 35个循环的一次性PCR得到了与理论值相符合产物 ,将RT -PCR产物直接克隆T载体 ,经K2 4毒株M片段的全基因序列共 36 5 3个核苷酸 ,四种核苷酸的酶切和PCR鉴定正确的克隆通过柱纯化后进行序列测定 ,结果比例分别为A 30 .4 4 % ,T30 .14 % ,G 2 0 .72 % ,C 18.70 % ,GC含量为 39.4 2 % ,AT含量为 6 0 .5 8% ,编码 1133个氨基酸。s片段的全基因序列共 1772个核苷酸 ,四种核苷酸的比例分别为A31.30 % ,G2 6 .0 5 % ,T2 2 .79% ,C19.77% ,GC含量为 4 5 .81% ,AT含量为 5 4 .19% ,共编码 4 2 9个氨基酸。K2 4株M片段核苷酸全基因和氨基酸与HTN型毒株同源率分别为 70 .7%～71.2 %和 75 .9%～ 76 .9% ,与sEO型为 95 .2 %～ 99.2 %和 95 .9%～ 99.4 %。s片段与HTN 76～ 118和sEOsR 11病毒的比较 ,核苷酸同源率分别为 74 .0 %和 95 .6 % ,氨基酸同源率为 83.3%和 97.9% ,与M片段的结果相类似。M片段氨基酸与sEO型 10个毒株存在 4个氨基酸替代。

关键词：汉坦病毒 s片段序列分析系统发生树 M片断基因结构

浅析口蹄疫病毒O/GsLX/CHN/2010株特征性s片段对病毒生物学特性的影响

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浅析口蹄疫病毒O/GSLX/CHN/2010株特征性S片段对病毒生物学特性的...

作者：姜韶东中国农业科学院

学位级别：硕士

2010-2011年,口蹄疫O型东南亚拓扑型Mya-98谱系病毒在东亚广泛流行,仅中、日、韩、蒙、俄5国有报道的疫情就达到337起,给各国畜牧业生产等造成严重损失。在这次流行中,有2起疫情分离到了具有特征性s片段的Mya-98谱系毒株。代表性毒株分... 详细信息

2010-2011年,口蹄疫O型东南亚拓扑型Mya-98谱系病毒在东亚广泛流行,仅中、日、韩、蒙、俄5国有报道的疫情就达到337起,给各国畜牧业生产等造成严重损失。在这次流行中,有2起疫情分离到了具有特征性s片段的Mya-98谱系毒株。代表性毒株分别为从中国香港分离的O/HKN/20/2010株和从中国甘肃省临夏回族自治州分离的O/GsLX/CHN/2010株。与其它Mya-98谱系流行毒相比,这两株病毒的s片段具有明显特征:首先,在其s片段核酸序列中部缺失70个碱基;此外,在s片段核酸序列后半部分还存在一些碱基突变。这一现象已经引起国内外同行的关注。为了研究这一特征性s片段对口蹄疫病毒生物学特性的影响,利用病毒反向遗传学技术,本文完成了以下几方面的工作。第一,构建了O/GsLX/CHN/2010株的感染性克隆;第二,用已建好的Mya-98谱系毒株O/GZsB/CHN/2010和O/GD/2/CHN/2010的感染性克隆为骨架,替换上O/GsLX/CHN/2010的特征性s片段,构建并拯救获得了嵌合病毒r GZexc和r GDexc,进而对嵌合病毒r GZexc、r GDexc的复制和对乳鼠致病力等进行了评价。结果表明:O/GsLX/CHN/2010株病毒复制较慢、对乳鼠致病能力较低;嵌合病毒的复制能力和对乳鼠致病力仍明显强于O/GsLX/CHN/2010株;整个O/GsLX/CHN/2010的s片段不能独自决定该毒株的生物学特性,O/GsLX/CHN/2010全基因组上的诸多变异综合导致其复制较慢,对乳鼠致病力较弱。但是,在这些变异中,O/GsLX/CHN/2010株L蛋白罕见的氨基酸插入突变对病毒生物学特性的影响值得关注。通过分析,推测s片段中部70 nt的缺失可能是其前体被某种核糖核酸酶一次性切割的结果。本研究为深入理解s片段的功能和造成O/GsLX/CHN/2010株低复制水平的机制等奠定了基础。

关键词：口蹄疫病毒反向遗传学 Mya-98拓扑型 s片段病毒生物学特性

汉坦病毒s片段编码产物在流行性出血热早期诊断中的应用研究

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汉坦病毒S片段编码产物在流行性出血热早期诊断中的应用研究

作者：周欣复旦大学

学位级别：硕士

流行性出血热是由汉坦病毒感染引起的一种急性传染病,临床上表现为发热、休克、出血、急性肾功能衰竭等症状。自1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来,各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。目前汉坦病... 详细信息

流行性出血热是由汉坦病毒感染引起的一种急性传染病,临床上表现为发热、休克、出血、急性肾功能衰竭等症状。自1978年李镐汪等从疫区的黑线姬鼠肺组织中分离到汉坦病毒76-118株以来,各国学者相继分离到不同型别的汉坦病毒。目前汉坦病毒已鉴定出多种型别:姬鼠型(Hantaan HTN),家鼠型(seoulsEO),(Puumala PUU),(sin Nombre sNN),(Dobrave DOB)等,在我国主要流行HTN和sEO 2种型别。我国每年发病人数4-7万,是世界上出血热的高发区,目前缺乏特异的治疗方法,因此,对流行性出血热的早期诊断和及时防治非常重要。汉坦病毒是分节段的负链RNA病毒,是布尼亚病毒科中一个独立的属,该病毒的基因由大L(6530-6550核苷酸),中M(3613-3707核苷酸),s(1696-2083核苷酸)三个RNA片段组成,这三个片段分别编码:依赖RNA的RNA聚合酶,糖蛋白G1和G2,核蛋白。其中核蛋白在不同型别之间具有较高的同源性,可以诱导体液免疫应答与细胞免疫应答。研究表明,其中核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,是早期诊断的最佳抗原。本文旨在探讨NP的抗原性,选择s片段的最佳抗原位点体外构建并表达NP,并将表达好的NP用于荧光定量PCR(RT-PCR),免疫滴金法(CGIDA),酶联免疫吸附法(ELIsA),对病人血清进行早期诊断。对临床及流行病学及早、准确地诊断、治疗汉坦病毒引起的流行性出血热至关重要。一.汉坦病毒RT-PCR检测试剂标准品的构建及其在早期诊断中的应用研究为了对汉坦病毒进行早期的定性检测,同时对核衣壳蛋白(NP)的抗原性和免疫原性进行进一步的探讨,我们采用76-118株的s片段构建荧光定量PCR(RT-PCR)标准品,并建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量PCR方法用于早期检测汉坦病毒核酸。首先对76-118株的s片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,对病毒RNA进行抽提,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。在s片段的保守区设计引物和TaqMan探针,对real-time PCR条件进行优化,并提取急性期发病病人总RNA,逆转录为cDNA,与标准品同时进行荧光定量PCR检测。同时用免疫荧光法(IFA)检测这些急性期病人的抗体滴度。实验结果表明:该方法制备的质粒标准品经荧光定量PCR扩增证实构建成功,应用于汉坦病毒早期检测,能对检测样品进行质量控制;应用荧光定量PCR同时对急性期病人和标准品进行病毒含量检测,保证了实验过程的一致性,具有高度特异性和灵敏度,从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,重复性好,并能在定性检测的基础上对病毒准确定量。实验表明本研究建立的汉坦病毒荧光定量标准品和TaqMan荧光定量PCR方法特异、敏感、快速,适用于汉坦病毒的早期检测;同时进一步证明了汉坦病毒s片段编码的核衣壳蛋白(NP)是流行性出血热早期诊断的理想抗原。二.汉坦病毒s片段编码蛋白原核表达载体的构建及重组蛋白的表达和纯化为了制备特异性强,灵敏度高的理想抗原,我们分段构建汉坦病毒76-118株核蛋白s基因核心区域原核表达质粒。首先从HTNV 76-118株感染的Vero-E6细胞中提取总RNA作为模板,根据NCBI提供的76-118国际标准序列设计引物,分3段进行目的基因PCR反应,经酶切、连接、转化、构建了HTN型汉坦病毒s片段的核心区域表达载体pGEX-4T-1-s1、pGEX-4T-1-s2、pGEX-4T-1-s3,并对重组产物进行测序。结果显示:重组产物的序列完全正确。我们对构建的载体进行原核表达,首先进行少量表达,并用蛋白质电泳和考马斯亮蓝染色,根据sDs-PAGE的结果显示,只有N端(34bp-340bp)克隆片段长度为334碱基,167氨基酸的表达载体pGEX-4T-1-s1在IPTG诱导下可表达。重组表达的蛋白存在于菌体包涵体中,重组表达的蛋白为167AA,约12KD,GsT的蛋白分子量为26KD,重组的融合蛋白总分子量为38KD。经大量表达后用Western-blot将重组蛋白与单克隆抗体和HFRs患者的高效价血清进行免疫印迹反应。在沉淀蛋白泳带相对分子质量38KD的位置,明显可见一条蛋白条带,与预计相对分子质量相符,故可初步确定其为插入基因的表达产物,成功构建了重组核蛋白原核表达载体pGEX-4T-1-s1,获得高纯度的抗原。三.汉坦病毒重组核衣壳蛋白在流行性出血热早期诊断中的应用流行性出血热是由汉坦病毒引起的人类急性传染病,自H

关键词：核蛋白 s片段荧光定量PCR 标准品原核表达免疫滴金法

汉坦病毒s片段荧光定量PCR参考标准品的构建

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上海预防医学 2006年第9期18卷 432-434页

作者：周欣李燕婷沈荣明沈微娟瞿涤复旦大学上海医学院医学分子病毒学教育部重点实验室上海200032 上海市疾病预防控制中心上海200336

[目的]构建汉坦病毒s片段标准品,用于实时荧光定量PCR检测汉坦病毒。[方法]对s片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,提取病人总RNA,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大... 详细信息

[目的]构建汉坦病毒s片段标准品,用于实时荧光定量PCR检测汉坦病毒。[方法]对s片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,提取病人总RNA,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。[结果]重组s片段基因质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明基因已成功克隆。以不同稀释水平的标准品进行扩增,统计学分析显示C t值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上。成功制备并获得稳定的s片段重组质粒。[结论]该方法能大量制备质粒标准品,如何进行荧光RT-PCR条件的优化是关键所在。

关键词： s片段实时荧光定量PCR 标准品

汉滩病毒s片段基因编码区在Vero-E_6细胞中的表达

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中国病毒学 1999年第2期14卷 181-184页

作者：张梦华王航雁杨为松黄长形李光玉汪毅白雪帆第四军医大学唐都医院传染科

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，主要引起人类肾综合征出血热［１］。我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区，该病起病急、病死率高，流行范围广，因此寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键。基因免疫是近年... 详细信息

汉滩病毒属于布尼亚病毒科汉坦病毒属，主要引起人类肾综合征出血热［１］。我国是肾综合征出血热发生和流行的主要疫区，该病起病急、病死率高，流行范围广，因此寻找安全有效、低廉的疫苗是控制本病流行和发生的关键。基因免疫是近年来微生物学和免疫学研究的新热点［２...

关键词：汉滩病毒基因表达 s片段编码区

安徽省2022年小兽携带汉坦病毒基因序列分析

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中国媒介生物学及控制杂志 2024年第3期35卷 261-267页

作者：陈晴晴侯银续陆皖行吴小珉吴磊徐庆华安徽省疾病预防控制中心微生物检验室/消毒杀虫科安徽合肥230601

目的了解安徽省小兽携带汉坦病毒情况及病毒基因型特征。方法2021年9月-2022年12月,安徽省按照《全国病媒生物病原学监测方案(试行)》采集小兽样本,运用反转录实时荧光定量PCR方法检测小兽肺标本汉坦病毒核酸,对阳性标本进行s片段全长... 详细信息

目的了解安徽省小兽携带汉坦病毒情况及病毒基因型特征。方法2021年9月-2022年12月,安徽省按照《全国病媒生物病原学监测方案(试行)》采集小兽样本,运用反转录实时荧光定量PCR方法检测小兽肺标本汉坦病毒核酸,对阳性标本进行s片段全长扩增、测序及基因序列分析。结果全省16个地市共检测4075份样本,包括8种小兽,其中褐家鼠、小家鼠、黄胸鼠和黑线姬鼠为优势种,分别占32.15%、21.87%、21.72%和20.86%。汉坦病毒核酸阳性率为1.47%(60/4075),包含汉滩病毒和首尔病毒。60份阳性标本通过交叉PCR法扩增获得19条s序列,遗传进化分析显示汉滩病毒属于H5亚型,首尔病毒为s3亚型,序列之间核苷酸相似性为72.00%~100%,氨基酸相似性为83.00%~100%。结论安徽省小兽中存在汉滩病毒和首尔病毒感染,应加强对小兽汉坦病毒的监测工作,为肾综合征出血热传染病防控提供科学依据。

关键词：肾综合征出血热汉坦病毒基因型 s片段

1株汉坦病毒的分离及其s基因片段的克隆和序列分析

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中国人兽共患病学报 2009年第7期25卷 665-668页

作者：徐芳姚苹苹朱函坪谢荣辉浙江省疾病预防控制中心杭州310051

目的对浙江省肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal syndrome，HFRs）疫区-龙泉，新分离到的毒株的s基因片段进行克隆并进行序列测定及分析，以确定毒株的型别和基因变异程度，为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。方... 详细信息

目的对浙江省肾综合征出血热（Hemorrhagic Fever with Renal syndrome，HFRs）疫区-龙泉，新分离到的毒株的s基因片段进行克隆并进行序列测定及分析，以确定毒株的型别和基因变异程度，为进一步研究病毒进化和变异提供了有利条件。方法采用直接免疫荧光检测疫区鼠肺HV抗原。将HV抗原阳性的鼠肺标本接种Vero-E6细胞，分离病毒。参考GenBank发表的汉坦病毒核蛋白基因序列，设计合成一对引物，提取分离株细胞培养物的总RNA，应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法扩增新毒株s片段基因，并克隆入载体，纯化后进行核苷酸序列测定及分析。结果成功分离到的新毒株s片段的全基因序列共1 700个核苷酸，只有一个开放读码框架，共编码429个氨基酸。新毒株与HTN型毒株比较，核苷酸同源率为85.7%-91.9%。与sEO型毒株比较，核苷酸同源率为71.2%-75%，表明该毒株为HTN型毒株。结论浙江HFRs疫区新分离汉坦病毒株可以定型为HTN型毒株，可能为新的亚型。

关键词：汉坦病毒病毒分离 s片段序列分析

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在我国发现普马拉病毒新亚型

病毒学报 2007年第4期23卷 320-325页

作者：唐丽华张全福修梅红扈光伟沈博杨显达梁米芳李德新传染病预防控制国家重点实验室中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所北京100052 吉林省疾病预防控制中心长春130062

对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测。其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份。对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异。系统进化分析表明,我... 详细信息

对我国东北地区捕获的157份棕背鼠平的肺组织进行普马拉病毒检测。其中免疫荧光检测出阳性标本1份,PCR检测出核苷酸阳性标本7份。对PCR产物进行测序后发现,其核苷酸的序列与报道的普马拉病毒核苷酸序列存在着差异。系统进化分析表明,我国发现的这株普马拉病毒,在进化树上形成了一个新的分支,为一新亚型。并且与在韩国和日本发现的普马拉病毒亲缘关系最为接近。

关键词：普马拉病毒 s片段 M片段核苷酸序列分析