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s期激酶相关蛋白1对肝内胆管细胞癌细胞增殖、侵袭能力的影响

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S期激酶相关蛋白1对肝内胆管细胞癌细胞增殖、侵袭能力的影响

作者：禹鹏飞河南大学

学位级别：硕士

目的探讨泛素链接酶E3核心组分s期激酶相关蛋白1（s-phase kinase-associated protein1 sKP1）在肝脏内胆管细胞癌组织及相邻的正常胆管组织表达差异。体外实验调控sKP1表达,进一步明确sKP1对肝内胆管细胞（RBE）的增殖、迁移及侵袭能... 详细信息

目的探讨泛素链接酶E3核心组分s期激酶相关蛋白1（s-phase kinase-associated protein1 sKP1）在肝脏内胆管细胞癌组织及相邻的正常胆管组织表达差异。体外实验调控sKP1表达,进一步明确sKP1对肝内胆管细胞（RBE）的增殖、迁移及侵袭能力的影响。方法收集25例于河南大学人民医院2017年8月至2019年4月接受根治性切除手术的肝脏内胆管细胞癌组织及其相邻2cm左右的正常胆管组织,术中组织离体后经家属过目,采集一定质量标本,装入冻存管中,液氮转运、保存,并做好详细登记。本研究经河南大学人民医院（河南省人民医院）伦理委员会批准,所有患者均签署标本收集知情同意书。培养人肝内胆管细胞癌细胞（RBE）及人胚肾细胞（293T）,掌握细胞传代规律。利用基因库,设计构建sKP1表达干扰载体和空白载体,运用慢病毒包装技术,稳定转染入肝内胆管癌细胞中,经抗生素筛选,构成实验组和对照组。蛋白裂解液提取组织蛋白和细胞蛋白,测定蛋白浓度,运用Western-Blot技术检测sKP1临床标本及稳转细胞的表达差异,统计分析,得出结论。当实验组和对照组构建成功后。CCK8测定吸光度计算两组平均相对生存率得出sKP1对RBE的增殖能力影响;划痕实验计数两组细胞穿过基线的平均数目反映sKP1对RBE迁移能力的影响;Transwell小室实验计数穿过小孔并被染上紫色的细胞数目间接反应sKP1对RBE的侵袭能力的影响。最终所有数据均使用sPss22.0进行统计学方法分析,结果用均数±标准差（Mean±sD）表示,两组间数据用t检验,结果以p＜0.05为差异有统计学意义。结果1、临床组织样本中,肝脏内胆管细胞癌组织中sKP1表达为正常胆管组织（1.701±0.215）倍,差异有统计学分析意义（t=8.512 p＜0.05）。2、慢病毒转染RBE细胞构建实验组和对照组成功,实验组sKP1表达降低,根据Western-Blot实验测定实验组sKP1表达较空白组降低（3.632±0.335）倍,差异有统计学分析意义（t=11.376 p＜0.01）。3、CCK8测得的实验组吸光度（A值）在24小时为0.316L/（g·cm）、48小时为0.524L/（g·cm）,72小时为0.527 L/（g·cm）。对照组平均吸光度为24小时0.594 L/（g·cm）,48小时为1.228 L/（g·cm）,72小时为1.503 L/（g·cm）。实验组较对照组平均相对生存率分别为（53.136±0.314）%、（42.661±0.248）%、（35.037±0.203）%,差异均有统计学分析意义（t分别为8.594 8.899 9.210 p＜0.05）。4、划痕实验显示24、48h实验组迁移的细胞平均数目（41.198±3.092）、（64.773±6.437）个较对照组（113.487±3.514）、（168.767±8.151）个明显降低,差异均有统计学分析意义（t分别为5.430 6.224 p＜0.05）。5、Transwell实验结果显示实验组穿过小孔细胞平均数目为（34.185±3.124）个较对照组（121.234±6.814）个明显降低,差异有统计学分析意义（t=9.918 p＜0.05）。结论1、肝脏内胆管细胞癌组织中sKP1表达高于正常胆管组织;2、降低sKP1表达能够有效地抑制肝内胆管细胞癌的增殖、迁移及侵袭能力。

关键词： s期激酶相关蛋白1 肝脏内胆管细胞癌泛素化增殖迁移侵袭

黄瓜s期激酶相关蛋白skp1的原核表达及其多克隆抗体的制备

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华北农学报 2017年第6期32卷 73-77页

作者：孙新艳魏莹韩晓玉王振跃陈琳琳燕照玲施艳河南农业大学植物保护学院河南郑州450002 河南省农业科学院河南郑州450002 河南省果树瓜类生物学重点实验室河南郑州450002

s期激酶相关蛋白1(skp1)是sCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白,在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究skp1的基因功能,通过反转录PCR扩增黄瓜skp1基因的全长阅读框,skp1基因全长阅读框由468个... 详细信息

s期激酶相关蛋白1(skp1)是sCF型E3泛素连接酶途径的核心蛋白,在真核生物的细胞周期、转录调控、信号传导等细胞进程中发挥关键作用。为了深入研究skp1的基因功能,通过反转录PCR扩增黄瓜skp1基因的全长阅读框,skp1基因全长阅读框由468个核苷酸组成,共编码155个氨基酸,将其通过酶切连接的方式克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a中,获得重组载体pETskp1,PCR验证及克隆测序确定开放阅读框的正确性。将重组质粒pETskp1转化大肠杆菌BL21菌株,通过IPTG诱导表达,sDs-PAGE分析表明,在37℃条件下,经IPTG(1 mmol/L)分别诱导3,6,9 h,skp1基因在大肠杆菌BL21中均得到高效表达,6,9 h对表达量的影响不明显,因此,可用3 h作为后期诱导表达蛋白的时间。将纯化的蛋白作为抗原,免疫新西兰大耳白兔,采集第5次后血清用ELIsA测定效价范围为1∶128000~512 000。提取黄瓜叶片的总蛋白,利用获得的抗血清进一步通过Western Blot检测特异性,结果表明,抗血清在500倍和1 000倍稀释时均能特异性地检测到黄瓜叶片中的skp1蛋白,条带大小在20 k Da左右,与预期的skp1蛋白大小一致。

关键词：黄瓜 s期激酶相关蛋白1 原核表达抗血清

宿主和病毒的F-Box蛋白在病毒感染过程中作用的研究进展

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吉林大学学报(医学版) 2024年

作者：许明秀桓晨吉林大学第一医院艾滋病与病毒研究所

F-Box蛋白家族是一类含有F-Box结构域的蛋白，与细胞s期激酶相关蛋白1 (sKP1)、Cullin1、环框蛋白1 (RBX1)共同形成sKP1-CUL1-F-Box (sCF) E3泛素连接酶复合物，该复合物介导底物发生泛素化修饰并经蛋白酶体途径降解。宿主F-Box蛋白在... 详细信息

F-Box蛋白家族是一类含有F-Box结构域的蛋白，与细胞s期激酶相关蛋白1 (sKP1)、Cullin1、环框蛋白1 (RBX1)共同形成sKP1-CUL1-F-Box (sCF) E3泛素连接酶复合物，该复合物介导底物发生泛素化修饰并经蛋白酶体途径降解。宿主F-Box蛋白在整个病毒感染周期中发挥关键作用。F-Box蛋白能够调控人类免疫缺陷病毒（HIV-1）和EB病毒（EBV）在内的多种RNA病毒和DNA病毒的复制，且调控机制均有所不同。在病毒进入宿主细胞后，宿主F-Box蛋白可以调控病毒复制过程中关键蛋白质的稳定性和降解，也可以增强病毒感染后宿主细胞的免疫应答，抑制病毒复制。部分F-Box蛋白能通过降解宿主限制因子、抑制病毒激活和干扰素信号通路等方式，协助病毒完成复制周期。病毒也可以通过编码含F-Box结构域的蛋白与宿主sKP1、Cullin1和RBX1蛋白结合，降解宿主因子促进自身复制。F-Box蛋白调控在病毒感染过程中发挥的作用差异较大，一种F-Box蛋白能够调控多种病毒的复制，一种病毒也能被多种F-Box蛋白所调控，现从宿主F-Box蛋白和病毒F-Box蛋白角度，对F-Box蛋白在病毒感染过程中的作用机制进行综述，探讨以F-Box蛋白作为靶点，开发新型抗病毒药物的意义和潜在价值。

关键词： F-Box蛋白病毒泛素蛋白酶体途径 s期激酶相关蛋白1 环框蛋白1

胃癌组织中FBXO45和sKP1蛋白表达及其临床预后意义

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药物生物技术 2020年第1期27卷 47-51页

作者：郭艳绒石蕾安康市人民医院肿瘤内科陕西安康725000

为了探讨胃癌组织中FBXO45与s期激酶相关蛋白1(sKP1)蛋白表达及其临床预后意义,选取2013年5月至2014年5月该院进行胃癌手术的60例患者作为研究对象。收集其癌组织标本及对应的癌旁组织标本,并采用免疫组化染色法检测其中FBXO45与sKP1蛋... 详细信息

为了探讨胃癌组织中FBXO45与s期激酶相关蛋白1(sKP1)蛋白表达及其临床预后意义,选取2013年5月至2014年5月该院进行胃癌手术的60例患者作为研究对象。收集其癌组织标本及对应的癌旁组织标本,并采用免疫组化染色法检测其中FBXO45与sKP1蛋白的表达水平,采用χ^2检验分析FBXO45与sKP1表达情况与胃癌临床病理特征的关系,多因素Cox回归分析探讨FBXO45与sKP1表达情况与预后的相关性。胃癌组织FBXO45、sKP1阳性表达率分别为33.33%,65.00%;癌旁组织FBXO45、sKP1阳性表达率分别为68.33%,30.00%,胃癌组织与癌旁组织中FBXO45、sKP1阳性表达比较存在明显差异(P期、低分化、出现淋巴结转移患者的FBXO45阴性表达率、sKP1阳性表达率均上升(P期、低分化、出现淋巴结转移、FBXO45阴性表达、sKP1阳性表达的胃腺癌患者生存时间均显著缩短(P期(HR=3.50,95%CI:2.32~5.29)、淋巴结转移(HR=3.13,95%CI:2.16~4.54)、肿瘤低分化(HR=3.76,95%CI:2.47~5.72)、FBXO45阴性表达(HR=2.69,95%CI:1.99~3.64)、sKP1阳性表达(HR=4.11,95%CI:2.51~6.74)均为影响胃癌预后的独立危险因素(PsKP1表达在胃癌组织中表达水平升高,FBXO45表达阴性与sKP1表达阳性均为胃腺癌患者预后危险因素,二者可作为判断胃癌预后的生物标志物。

关键词：胃癌 FBXO45 s期激酶相关蛋白1 临床特征预后生物标志物

干扰sKP1基因对帕金森病细胞模型凋亡及泛素蛋白酶体系统的调控机制

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中华行为医学与脑科学杂志 2022年第11期31卷 976-983页

作者：孙振杰佟强高琪卢婷陈泉田向阳孙波南京医科大学附属淮安市第一人民医院神经内科淮安223000

目的探讨干扰s期激酶相关蛋白1(s-phase kinase associated protein 1,sKP1)基因对1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导致帕金森病(Parkinson's disease,PD)细胞模型凋亡及泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPs)降解α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)机制的影响。方法将sH-sY5Y细胞分为对照组、MPP+组、sKP1干扰组、sKP1干扰+MG132(UPs抑制剂)组,对照组细胞正常培养,后三组细胞先用MPP+(0.5 mmol/L)孵育24 h作为PD模型细胞,sKP1干扰组转染慢病毒sKP1-siRNA,sKP1干扰+MG132组转染慢病毒sKP1-siRNA后加入MG132(0.5μmol/L)干预24 h。采用RT-PCR和Western blot检测细胞中sKP1、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein l light chain 3,LC3)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosome-associated membrane protein,LAMP2)、α-syn、泛素激活酶E1(ubiquitin activating enzyme E1,UBE1)、parkin、p27的基因和蛋白表达水平;流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期水平,CCK-8法检测细胞增殖水平;采用免疫共沉淀法探究sKP1与p27的相互作用。使用sPss 23.0软件进行统计学分析,多组间比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用LsD检验。结果RT-PCR和Western blot结果显示,四组细胞的自噬相关蛋白及泛素相关蛋白LC3、LAMP2、α-syn、UBE1、parkin、p27的mRNA(F=99.155,43.028,138.464,28.200,22.009,28.147,均P蛋白(F=245.517,157.634,315.920,2336.472,477.429,2350.201,均PsKP1干扰组LC3、LAMP2、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均低于MPP+组(均P蛋白表达水平均高于MPP+组(均PsKP1干扰+MG132组LC3、α-syn、p27的mRNA和蛋白表达水平均高于sKP1干扰组(均P蛋白表达水平均低于sKP1干扰组(均PsKP1干扰组细胞凋亡率低于MPP+组[(8.22±0.25)%,(15.30±0.21)%,PsKP1干扰+MG132组细胞凋亡率[(9.49±0.07)%]高于sKP1干扰组,细胞抑制率[(36.06±2.85)%]高于sKP1干扰组(均PsKP1免疫沉淀后,p27随之减少。结论干扰sKP1基因后,PD细胞自噬功能降低,可能与parkin促使α-syn发生泛素化,激活UBE1/parkin介导UPs通路降解α-syn,并介导P27抑制细胞凋亡有关。

关键词：帕金森病泛素-蛋白酶体系统 s期激酶相关蛋白1 α-突触核蛋白细胞凋亡

sKP1、sKP2对肾癌预后的预测作用分析

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浙江医学 2022年第19期44卷 2075-2080,I0005,I0006页

作者：杨伟芳杨海华冉刚皮文虎王学全浙江省台州医院放疗科 317000

目的分析s期激酶相关蛋白1(sKP1)和s期激酶相关蛋白2(sKP2)表达水平对肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌这3种肾癌患者预后的预测作用。方法使用TCGA数据库中肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌样本进行sKP1和sKP2... 详细信息

目的分析s期激酶相关蛋白1(sKP1)和s期激酶相关蛋白2(sKP2)表达水平对肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌这3种肾癌患者预后的预测作用。方法使用TCGA数据库中肾透明细胞癌、肾嫌色细胞癌、肾乳头状细胞癌样本进行sKP1和sKP2表达水平及其甲基化与预后相关性分析、不同表达水平间基因突变情况分析。采用Metascape数据库分析sKP2在这3种肾癌中共表达基因功能富集情况及蛋白质相互作用情况。结果与正常组织比较,sKP1表达水平在这3种肾癌中均显著降低,sKP2在肾透明细胞癌和肾乳头状细胞癌中显著升高。在这3种肾癌中sKP2高表达者预后均较差,AUC值和一致性指数提示预测准确性稳定。肾癌中多个甲基化位点与sKP1或sKP2表达水平及预后显著相关。肾透明细胞癌中sKP1和sKP2突变占14%。KMT2C、HERC2、PRKDC、sETD2和HMCN1基因突变与sKP1或sKP2表达水平高低相关。肾癌中sKP2共表达基因富集部分与免疫应答调节相关。结论sKP2及其甲基化可以预测肾癌预后。肾癌中sKP1、sKP2表达高低与KMT2C、HERC2、PRKDC、sETD2和HMCN1等基因突变相关,并受多种甲基化位点影响。

关键词：肾癌 s期激酶相关蛋白1 s期激酶相关蛋白2 预后