检索结果-南通市图书馆

Apoptosis of mesenchymal stem cells is regulated by rspo1 via the Wnt/β-catenin signaling pathway

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Chronic Diseases and Translational Medicine 2019年第1期5卷 53-63页

作者： Xiao-Xia Cheng Qiao-Yan Yang Yong-Li Qi Zhi-Zhen Liu Dan Liu Sheng He Li-Hong Yang Jun Xie Department of Biochemistry and Molecular Biology Shanxi Medical University Taiyuan Shanxi 030001 China The First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University Taiyuan Shanxi 030001 China Huaihe Hospital of Henan University Kaifeng Henan 475000 China Department of Pathology Shanxi Medical University Taiyuan Shanxi 030001 China

Objective: The aim of this study was to investigate the effect and possible mechanism of action of roof plate-specific spondin1 (rspo1) in the apoptosis of rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs). Methods: Osteogenic and adipogenic differentiation of BMSCs was identified by Alizarin Red and Oil Red O staining, respectively. BMSC surface markers (cluster of differentiation 29 [CD29], CD90, and CD45) were detected using flow cytometry. BMSCs were transfected with an adenoviral vector encoding rspo1 (BMSCs-rspo1 group). The expression levels of rspo1 gene and rspo1 protein in the BMSCs-rspo1 group and the two control groups (untransfected BMSCs group and BMSCs-green fluorescent protein [GFP] group) were analyzed and compared by quantitative polymerase chain reaction and Western blot. The occurrence of apoptosis in the three groups was detected by flow cytometry and acridine orange-ethidium bromide (AO-EB) double dyeing. The activity of the Wnt/β-catenin signaling pathway was evaluated by measuring the expression levels of the key proteins of the pathway (β-catenin, c-Jun N-terminal kinase [JNK], and phospho-JNK). Results: Osteogenic and adipogenic differentiation was confirmed in cultured BMSCs by the positive expression of CD29 and CD90 and the negative expression of CD45. Significantly increased expression levels of rspo1 protein in the BMSCs-rspo1 group compared to those in the BMSCs (0.60 ± 0.05 vs. 0.13 ± 0.02;t=95.007, P=0.001) and BMSCs-GFP groups (0.60 ± 0.05 vs. 0.10 ± 0.02;t=104.842, P=0.001) were observed. The apoptotic rate was significantly lower in the BMSCs-rspo1 group compared with those in the BMSCs group ([24.06 ± 2.37]% vs.[40.87 ± 2.82]%;t =49.872, P =0.002) and the BMSCs-GFP group ([24.06 ± 2.37]% vs.[42.34 ± 0.26]%;t =62.358, P =0.001). In addition, compared to the BMSCs group, the protein expression levels of β-catenin (2.67 ± 0.19 vs. 1.14 ± 0.14;t =-9.217, P =0.000) and JNK (1.87 ± 0.17 vs. 0.61 ± 0.07;t =-22.289, P =0.000) were increased in the BMSCs-rspo1 group. Compared to the BMSC

关键词： rspo1 Bone marrow mesenchymal stem cells Apoptosis Wnt/β-catenin signaling pathway

rspo1在淇河鲫卵巢发育中的表达和功能研究

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Rspo1在淇河鲫卵巢发育中的表达和功能研究

作者：辛晴晴河南师范大学

学位级别：硕士

R-spondin1(rspo1)在哺乳动物及部分硬骨鱼类早期雌性性别决定与分化中起着重要的作用。然而,在哺乳动物以及硬骨鱼类中,rspo1不仅在性腺分化早期高表达,在成体雌性性腺中也维持在较高水平,其在后续性腺发育中的功能还未知。鉴于此,本... 详细信息

R-spondin1(rspo1)在哺乳动物及部分硬骨鱼类早期雌性性别决定与分化中起着重要的作用。然而,在哺乳动物以及硬骨鱼类中,rspo1不仅在性腺分化早期高表达,在成体雌性性腺中也维持在较高水平,其在后续性腺发育中的功能还未知。鉴于此,本研究以淇河鲫(Carassius auratus)为实验动物模型,通过形态学和组织学进行卵巢发育分期,同时制备rspo1多克隆抗体,检测rspo1在各时期卵巢的表达。通过RNA干扰技术对rspo1进行敲降,研究rspo1降低对卵巢发育以及卵母细胞成熟的影响,初步揭示rspo1在硬骨鱼类卵巢发育中的功能。主要研究结果如下:1.通过对卵巢形态和组织学观察,依据淇河鲫卵巢和卵母细胞的发育状态将淇河鲫的卵巢分为5个发育时期:Ⅰ期卵巢,性腺呈微微泛红的透明细线状,表面布有黑色斑点黏膜,性腺内充满第Ⅰ时相卵母细胞,该时相卵母细胞呈不规则的圆形;Ⅱ期卵巢,性腺呈浅红色的扁平带状结构,表面有少量毛细血管分布,性腺内充满大量第Ⅱ时相卵母细胞,该时相卵母细胞呈圆形或椭圆形,细胞核中核仁数目较多;Ⅲ期卵巢,性腺体积明显增大为囊状,颜色为淡粉色,有少量卵粒生成,该时期卵巢中第Ⅲ时相卵母细胞较多,卵母细胞细胞质中出现皮质液泡,并有放射带形成;Ⅳ期卵巢,膨胀至饱满囊状结构,肉眼可见大量卵粒,此时,第Ⅳ时相卵母细胞几乎占据整个卵巢,该时相卵母细胞体积较大,并有卵黄物质生成;Ⅴ期卵巢,柔软膨大,卵粒已经成熟,颜色为黄色,此时卵巢已经发育成熟,卵巢内充满第Ⅴ时相卵母细胞,此时细胞体积达到最大,卵黄颗粒几乎占据整个卵母细胞。2.定量结果显示,rspo1在Ⅰ-Ⅴ期卵巢都有表达,在Ⅱ期表达量最高,随后从Ⅲ期降低。为了研究rspo1蛋白在各时期性腺的表达情况,我们制备了rspo1多克隆抗体。Western Blot结果表明,rspo1在淇河鲫的脑、鳃、肠、肌肉等8个组织中均有表达,在脑和肌肉中表达最高,在卵巢、肠、肝组织表达量居中。在不同发育时期卵巢中,rspo1在Ⅰ期和Ⅱ期卵巢表达量较高,其他时期的表达量较低。免疫组化结果显示,rspo1在Ⅰ期卵巢中的卵原细胞、第I时相卵母细胞以及周边的体细胞表达,在Ⅱ期卵巢中第Ⅱ时相卵母细胞的细胞质以及卵原细胞中表达,随着卵巢的发育,在Ⅲ期卵巢中,rspo1在第Ⅱ时相和第Ⅲ时相卵母细胞中表达,但是在发育成熟期性腺(第Ⅳ期、第Ⅴ期)的第Ⅳ时相、第V时相卵母细胞中几乎不表达,只在卵母细胞周边的颗粒细胞和间质细胞表达。以上结果暗示rspo1可能调控淇河鲫卵巢发育进程。3.本研究应用RNA干扰技术成功构建rspo1干扰模型。在体外合成rspo1基因dsRNA,经不同浓度dsRNA的注射以及不同效应时间的分析,发现2μg/g和5μg/g为最佳注射浓度,注射后5天为最佳效应时间。因而向卵巢中注射2μg/g和5μg/g dsRNA作为低浓度和高浓度干扰组,在淇河鲫Ⅱ期卵巢发育早期和晚期分别进行长期RNA干扰实验。结果显示,rspo1在Ⅱ期早期干扰30天后,对卵巢以及卵母细胞的成熟状态无显著影响,但是导致卵母细胞数量减少。定量结果显示,雌性发育相关基因β-catenin、foxl2、cyp19a1a、figlα显著下调,雄性发育相关基因cyp11b2、dmrt1无显著性变化。促凋亡因子Caspase3、p53显著上调,细胞增殖基因PCNA、ki67无显著变化。然而,在Ⅱ期晚期卵巢进行60天干扰后,卵巢萎缩,卵粒数量相对减少,卵巢发育受阻,卵母细胞大都停留在第Ⅱ或第Ⅲ时相。对照组性腺中存在大量第Ⅳ、Ⅴ时相卵母细胞,实验组卵巢卵母细胞中卵黄颗粒生成明显减少,未达到第Ⅳ、Ⅴ时相。ELISA结果显示实验组肝脏和血清中卵黄蛋白原含量显著下降;血清中雌激素含量显著降低。定量结果显示cyp19a1a的水平显著下调。与早期干扰效果类似,晚期干扰后,雌性基因表达量明显下调,雄性基因无显著变化,促凋亡因子显著上调。以上结果显示,rspo1的干扰影响卵巢发育以及卵母细胞的成熟。4.我们同时对Ⅱ期晚期干扰后性腺进行转录组测序。质控后获得较高质量的测序数据,样本的质量评估相关系数Q20(%)在97%以上、Q30(%)在93%以上。转录组数据分析发现,与对照组相比,rspo1干扰卵巢中有132个基因表达显著上调,133个基因表达显著下调,表明rspo1干扰后卵巢中的多种基因表达受到影响。对差异表达基因进行GO和KEGG富集分析显示,差异表达基因主要富集到的多种生物学过程以及信号通路。在GO富集中发现20项GO term,其中包括6项生物学过程,7项分子功能,7项细胞成分。其中与该实验背景联系较密切的有与卵巢发育过程相关的生殖过程(reproductive process)、发育过程(developmental process)、代谢过程(metabolic process)、转录因子调节活性(transcription regul

关键词：淇河鲫 rspo1 卵巢发育 RNA干扰雌激素卵黄蛋白原

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

rspo1在妊娠期糖尿病中的表达及意义

Rspo1在妊娠期糖尿病中的表达及意义

作者：张彬彬大连医科大学

学位级别：硕士

目的:本课题拟通过研究rspo1蛋白在妊娠期糖尿病与正常妊娠孕妇血清及胎盘中的表达差异,并进一步探讨rspo1蛋白与胰岛素抵抗的关系,从而阐明rspo1蛋白在妊娠期糖尿病发病机制中的作用。方法:随机选取2020年7月至2021年1月在青岛市市立... 详细信息

目的:本课题拟通过研究rspo1蛋白在妊娠期糖尿病与正常妊娠孕妇血清及胎盘中的表达差异,并进一步探讨rspo1蛋白与胰岛素抵抗的关系,从而阐明rspo1蛋白在妊娠期糖尿病发病机制中的作用。方法:随机选取2020年7月至2021年1月在青岛市市立医院产科规律产检、分娩方式为剖宫产的单胎妊娠孕妇60例,其中妊娠期糖尿病孕妇30例,作为GDM组,同期糖耐量正常的30例孕妇作为对照组。排除妊娠合并内外科疾病、合并其他内分泌疾病、合并传染病等。(1)分析两组孕妇年龄、体质量指数(BMI)、孕周情况等一般资料差异;(2)检测两组孕妇空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)水平,应用胰岛素稳态模型评估法(HOMA)计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);(3)酶联免疫吸附实验(Elisa)检测两组孕妇血清中rspo1蛋白的表达差异;(4)实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测两组孕妇胎盘中rspo1 m RNA的表达差异;(5)免疫组织化学及Western blot分析两组孕妇胎盘中rspo1蛋白的表达差异;(6)分析GDM孕妇血清中rspo1表达水平与BMI、FBG、FINS及HOMA-IR的相关性。结果:(1)两组相关指标分析结果显示,GDM组与对照组的FBG水平分别为5.35±0.35mmol/L、4.33±0.22 mmol/L;GDM组与对照组的FINS水平分别为12.33±0.90m U/L、6.49±0.61m U/L;GDM组与对照组的HOMA-IR值分别为2.93±0.25、1.25±0.16。GDM孕妇的FBG、FINS、HOMA-IR水平较正常妊娠孕妇明显升高,差异有统计学意义(P1)。(2)Elisa实验结果显示,GDM组与对照组的rspo1蛋白表达水平分别为566.88±181.34pg/m L、377.00±166.83pg/m L。GDM组血清rspo1表达量较对照组明显升高,差异有统计学意义(P1)。(3)RT-PCR结果显示,GDM组rspo1 m RNA的表达量为1.46±0.61,对照组rspo1 m RNA的表达量为0.80±0.69。GDM孕妇对比正常妊娠孕妇胎盘中rspo1m RNA表达明显升高,差异有统计学意义(P1)。(4)免疫组化结果显示,rspo1蛋白在GDM和正常妊娠孕妇的胎盘组织中均有表达,GDM孕妇胎盘组织中rspo1蛋白的表达明显高于正常妊娠孕妇,差异有统计学意义(P1);rspo1蛋白主要表达于胎盘滋养细胞的细胞质。(5)Western blot结果显示,rspo1蛋白在GDM组胎盘组织中的表达水平为0.34±0.08,在对照组胎盘组织中的表达水平为0.21±0.09。GDM孕妇胎盘组织rspo1蛋白表达水平与正常妊娠孕妇相比升高,差异有统计学意义(Prspo1水平与FINS、HOMA-IR呈现明显正相关性(P1)。结论:1.GDM孕妇血清及胎盘组织中rspo1表达量明显高于正常孕妇。2.GDM孕妇血清rspo1表达水平与胰岛素抵抗指数呈正相关,血清rspo1表达水平可反应胰岛素抵抗程度。3.rspo1可能通过调节胰岛素分泌及胰岛素抵抗参与GDM的发病。

关键词：妊娠期糖尿病 rspo1 胰岛素抵抗

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

rspo1在雌性脊椎动物性别分化中的功能

中国生物化学与分子生物学报 2015年第8期31卷 801-805页

作者：方梦蝶张衍梅王孝举浙江省医学科学院分子医学中心杭州310013

长期以来雌性脊椎动物的性别分化被认为是一个"默认"的程序.但是近些年研究发现,rspo1基因的突变或缺失可导致哺乳动物XX型个体性反转为雄性.rspo1在鱼类、两栖爬行类、鸟类和哺乳类动物性腺发育的不同阶段表达,其表达在雌雄个体性别分... 详细信息

长期以来雌性脊椎动物的性别分化被认为是一个"默认"的程序.但是近些年研究发现,rspo1基因的突变或缺失可导致哺乳动物XX型个体性反转为雄性.rspo1在鱼类、两栖爬行类、鸟类和哺乳类动物性腺发育的不同阶段表达,其表达在雌雄个体性别分化时期有差异,是潜在的性别调控基因.rspo1在性别发育早期可通过Wnt/β-catenin信号通路调控性腺分化相关因子的表达,影响原始生殖细胞分裂增殖、细胞周期和生长发育,参与调控性腺中体细胞的分化.本文总结了近年来rspo1在脊椎动物中的表达调控及其在雌性性别决定方面功能的研究进展.

关键词： rspo1 β-catenin Foxl2 雌性性别分化原始生殖细胞体细胞

rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路调节成骨细胞分化的研究进展

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

中国骨质疏松杂志 2015年第4期21卷 504-507页

作者：彭杨茜子刘庆梅马彦云王久存赵东宝上海长海医院风湿免疫科上海200433 复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室及现代人类学教育部重点实验上海200433

在成骨细胞的分化增殖中,经典Wnt/β-catenin通路起着重要的调节作用;此通路中的任何一个因子都能影响成骨细胞的分化增殖。近几年里,大量研究证明R-脊椎蛋白家族已成为Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子。本文就rspo1通过Wnt/β-ca... 详细信息

在成骨细胞的分化增殖中,经典Wnt/β-catenin通路起着重要的调节作用;此通路中的任何一个因子都能影响成骨细胞的分化增殖。近几年里,大量研究证明R-脊椎蛋白家族已成为Wnt/β-catenin信号通路的重要调节因子。本文就rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路调控影响成骨细胞分化增殖的研究进展作一综述。

关键词： rspo1 Wnt/β-catenin信号通路成骨细胞 rspo1

rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

Rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤

作者：陆婷苏州大学

学位级别：硕士

随着核工业的发展，核科学技术的广泛应用以及核恐怖袭击的威胁，如何救治急性辐射损伤成为了当今迫切的需求。肠道对电离辐射十分敏感，肠上皮结构和功能受损是急性辐射性病难以救治的关键因素之一。肠隐窝干细胞及其干细胞龛遭受严重... 详细信息

随着核工业的发展，核科学技术的广泛应用以及核恐怖袭击的威胁，如何救治急性辐射损伤成为了当今迫切的需求。肠道对电离辐射十分敏感，肠上皮结构和功能受损是急性辐射性病难以救治的关键因素之一。肠隐窝干细胞及其干细胞龛遭受严重破坏，是肠隐窝-绒毛更新障碍的根本原因，是肠上皮结构和功能放射性损伤的关键病理机制。因此，亟待根据急性放射性病病程中肠上皮结构和功能损伤的病理机理特点，提出新型有效的针对性救治策略。间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）是一群来源于中胚层，异质性很强的具有自我更新能力的多能干细胞，能分化为脂肪细胞，成骨细胞，软骨细胞，肝细胞，神经元细胞，肌细胞，上皮细胞等细胞。此后大量研究表明，间充质干细胞可趋化至受伤发炎的部位，具备潜在的免疫调节能力，抗炎能力和营养作用，是组织工程，再生医学和自身免疫性疾病治疗的理想工具。新近发现的一种可溶性分子rspo1（R-spondin1）可通过结合肠隐窝干细胞表面Lgr5和Lgr4的受体、竞争抑制Wnt通路拮抗剂DKK1等机制，调节并增强活化Wnt/β-catenin信号，促进肠隐窝干细胞增殖和分化。另外，人rspo1可作用于小鼠肠隐窝干细胞，产生促增殖、分化和生存作用。鉴此，本文建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型并观察了其损伤规律，通过基因转染的方法构建了一株稳定表达人rspo1分子的间充质干细胞株并鉴定了其生物学活性，利用rspo1基因转染的间充质干细胞株过继输注肠上皮辐射损伤小鼠，通过间充质干细胞发挥的免疫调节作用与rspo1/β-catenin途径刺激肠隐窝干细胞增殖和分化的作用相联合，修复肠隐窝-绒毛更新机制，以期为急性放射病的有效救治提供新思路。一、肠上皮辐射损伤小鼠模型的建立及病理损伤规律【目的】建立肠上皮辐射损伤小鼠模型，观察损伤病理变化规律。【方法】分别以10Gy、12Gy、14Gy、16Gy和18Gy剂量单纯照射小鼠腹部，确定单纯腹部照射的最小致辐射死剂量。进而采用18Gy剂量照射Lgr5-EGFP-ires-CreERT2转基因小鼠，每日观察小鼠体重，并在辐照后0.5d、3.5d和6d取小鼠小肠，观察小肠的病理学改变规律，如小肠绒毛长度、肠隐窝数目以及肠隐窝Lgr5+干细胞的数量变化。【结果】18Gy为单纯腹部照射建立肠上皮辐射损伤小鼠模型的最小致死剂量;与未处理组相比，腹部照射后小鼠体重逐步减轻、小肠绒毛变短、隐窝数目减少、肠隐窝干细胞数量在短时间内迅速减少。【结论】本部分研究采用18Gy剂量单纯辐照小鼠腹部，建立了肠上皮辐射损伤小鼠模型。在此基础上观察了肠上皮辐射损伤病理规律。这为急性辐射损伤救治的研究提供了良好的研究工具。二、rspo1基因转染间充质干细胞株的构建及生物学活性鉴定【目的】构建稳定表达rspo1的基因转染间充质干细胞株。【方法】将人rspo1全长cDNA重组入逆转录病毒载体pEGZ-Term，通过与辅助病毒载体共转染293T细胞，包装为具有感染力的完整重组病毒载体，收集培养上清感染间充质干细胞C3H10T1/2细胞株，筛选获得G418抗性的基因转染细胞，通过RT-PCR与流式细胞术检测感染后C3H10T1/2细胞rspo1分子的表达，并采用细胞计数法观察其上清对结肠癌细胞株SW480增殖能力的促进作用。【结果】成功构建pEGZ-Term/rspo1逆转录病毒表达载体，获得了稳定表达人rspo1的基因转染细胞株C3H10/rspo1，该细胞株上清能促进SW480结肠癌细胞增殖。【结论】建立了稳定表达rspo1的基因转染间充质干细胞株，并证实其分泌的rspo1具有生物学活性，为进一步利用rspo1和间充质干细胞联合靶向作用于肠道干细胞救治肠上皮损伤的研究奠定了基础。三、rspo1基因转染间充质干细胞修复小鼠肠上皮辐射损伤【目的】利用间充质干细胞的保护作用联合rspo1靶向修复肠上皮辐射损伤小鼠。【方法】采用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株表面趋化因子受体和相关负性免疫分子的表达;通过胞内染色的方法，利用流式细胞术检测C3H10T1/2细胞株内相关免疫抑制与激活细胞因子的表达;利用ELISA法检测C3H10T1/2细胞上清中PEG2的含量;采用18Gy辐照剂量单纯照射小鼠腹部，将PBS、C3H10T1/2细胞株、第二部分构建的C3H10/mock细胞株及C3H10/rspo1细胞株分别移植入肠上皮辐照损伤小鼠，每日观察小鼠的生存状况及体重变化。【结果】C3H10T1/2细胞株可表达趋化因子受体CXCR4和PD-L1、B7H3、B7H4等多种负性免疫分子，产生TGF-β、IL-10、IL-4和分泌PGE2等免疫抑制因子;对于肠上皮辐照损伤小鼠，C3H10/rspo1移植组小鼠的存活率大于单纯C3H10T1/2移植组小鼠的存活率，而PBS移植组小鼠在两周内全部死亡，同时C3H10/Rs

关键词： rspo1 间充质干细胞基因转染辐射损伤肠道干细胞

rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路抑制大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路抑制大鼠骨髓间充质干细胞凋亡

作者：程肖霞山西医科大学

学位级别：硕士

目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)在疾病治疗中具有一定疗效,但移植体内的BMSCs的存活率和活力有限,对病人生活质量的提高不太理想,而移植的干细胞的凋亡可能是影响干细胞存活率低的重要原因之一,因此本课题通过培养大鼠BMSCs,编码rspo1的... 详细信息

目的:骨髓间充质干细胞(BMSCs)在疾病治疗中具有一定疗效,但移植体内的BMSCs的存活率和活力有限,对病人生活质量的提高不太理想,而移植的干细胞的凋亡可能是影响干细胞存活率低的重要原因之一,因此本课题通过培养大鼠BMSCs,编码rspo1的腺病毒转染BMSCs,研究rspo1是否具有抑制BMSCs凋亡的功能,并进一步探索其抑制凋亡的机制是否与Wnt/β-catenin信号通路有关。方法:1.全骨髓贴壁法提取并培养BMSCs;2.成骨、成脂分化诱导鉴定BMSCs分化潜能;3.流式检测BMSCs表面标志物CD29、CD90、CD45;4.编码rspo1腺病毒转染BMSCs,BMSCs分为三组:BMSCs组、BMSCs-GFP组和BMSCs-rspo1组;5.qPCR和Western-blot分别检测rspo1基因和rspo1蛋白在三组细胞中的表达水平;6.分别用流式和AO-EB双染检测BMSCs凋亡率;7.Western-blot检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3的表达水平;8.qPCR和Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin、JNK和phospho-JNK在三组细胞中的表达水平;9.加入Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂LGK974后,检测凋亡相关蛋白Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3和Wnt/β-catenin信号通路中关键因子β-catenin、JNK和phospho-JNK在三组细胞中的表达水平。结果:1.培养的BMSCs经成骨成脂诱导分化后,可见红褐色类圆形钙结节和橘红色圆形脂滴形成;2.流式检测BMSCs表面标志物CD29表达率为(97.1±0.76%),CD90表达率为(95.83±0.76%),CD45表达率为(3.93±0.6%);3.qPCR和Western blot结果显示:BMSCs-rspo1组rspo1基因和rspo1蛋白表达均明显高于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);4.流式检测凋亡结果显示:BMSCs-rspo1组的凋亡率(25.02±3.58)%明显低于BMSCs组(43.63±2.16)%和BMSCs-GFP组(44.56±2.04)%(p﹤0.01);5.AO-EB双染检测凋亡结果显示:BMSCs-rspo1组中绿色和橘红色并呈固缩状或圆珠状的早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞明显少于BMSCs组和BMSCs-GFP组;6.Western blot结果显示:BMSCs-rspo1组Bax,Caspase3和Cleavage-Caspase3蛋白表达均明显低于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);7.BMSCs-rspo1组中CTNNB1和JNK基因和β-catenin、JNK和phospho-JNK蛋白表达水平均明显高于BMSCs组和BMSCs-GFP组(p﹤0.01);8.加入Wnt/β-catenin信号通路的阻断剂LGK974后,Western blot结果显示:BMSCs-rspo1+LGK974组CTNNB1和JNK基因和β-catenin、JNK和phospho-JNK蛋白表达水平明显低于BMSCs-rspo1组(p﹤0.01),Bax、Caspase3和Cleavage-Caspase3蛋白表达均明显高于BMSCs-rspo1组(p﹤0.01),BMSCs-rspo1+LGK974组与BMSCs组无明显差异。结论:1.全骨髓贴壁分离法培养得到状态良好的BMSCs。2.rspo1在腺病毒转染的BMSCs中成功高表达。3.高表达rspo1可抑制BMSCs的凋亡。4.rspo1抑制BMSCs的凋亡可能与Wnt/β-catenin信号通路有关。

关键词： rspo1 骨髓间充质干细胞凋亡 Wnt/β-catenin信号通路

rspo1通过Wnt信号通路促进成骨细胞分化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Rspo1通过Wnt信号通路促进成骨细胞分化

作者：彭杨茜子第二军医大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。其病理特点是关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成。研究表明,Wnt信号通路同类风湿关节炎引起的骨代谢改变有着密切的联系,在类风湿关节炎患者病情发展中,Wnt信号途径受抑,... 详细信息

类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。其病理特点是关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成。研究表明,Wnt信号通路同类风湿关节炎引起的骨代谢改变有着密切的联系,在类风湿关节炎患者病情发展中,Wnt信号途径受抑,进而抑制了成骨细胞增殖、分化,促进了骨质疏松、骨质侵蚀的发展。近几年,rspo1(R-脊椎蛋白1)作为Wnt信号通路的激活剂被研究甚多,但不清楚它能否通过激活Wnt信号通路作用于成骨细胞。目前尚无有效的措施来改善和延缓类风湿关节炎骨侵蚀病情的进展,明确其骨侵蚀发生机制可为类风湿关节炎骨侵蚀的临床治疗提供科学依据。一、研究目的本实验通过构建含有TCF荧光素酶报告基因的C2C12细胞,检测其在rspo1、Wnt-3a等刺激下,骨保护素、碱性磷酸酶及胞内β-catenin蛋白含量的变化,以研究rspo1是否通过Wnt信号通路来促进成骨细胞分化,从而为防治类风湿关节炎骨侵蚀增添新理论和新手段。二、研究方法采用DMEM培养基对C2C12细胞进行原代培养和传代培养。将扩增了的C2C12细胞进行计数,以4×104/ml的浓度加入48孔培养基中继续培养备用。首先,采用Roche公司x CELLIgence技术的细胞动力学模型分析系统,研究rspo1及Wnt3a对C2C12细胞增殖的影响。其次,应用Lipofectamine 2000将TCF报告质粒及p RL-SV40报告质粒共转染入C2C12细胞,继续培养。接着,我们通过检测骨成熟标志物碱性磷酸酶、骨保护素来验证rspo1对C2C12细胞的作用。处理组细胞加入50ng/ml的rspo1刺激因子,空白对照组为空,采用ELASA检测法,收集各组细胞上清液测骨保护素水平,裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平。随后增加了50ng/ml Wnt3a组和50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组,同样采用ELASA检测法,收集各组细胞上清液测骨保护素水平,裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平,并采用SPSS17.0统计软件对数据进行方差分析。β-catenin蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白,其进入核内后可与TCF质粒相结合,从而激活下游靶基因的转录。通过对TCF荧光素酶报告基因和β-catenin蛋白的检测可反应Wnt信号通路的激活状态。接着,C2C12细胞转染入TCF报告质粒及p RL-SV40报告质粒6h后,更换含不同浓度的rspo1、Wnt3a及两者都有的新鲜完全培养基,24h后应用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统检测报告基因转录活性。最后,我们对50ng/ml rspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组细胞的β-catenin蛋白进行Western blot检测,并进行统计学分析。三、结果1.xCELLIgence系统检测显示rspo1对C2C12细胞增殖没有影响,Wnt3a对C2C12细胞增殖有促进作用。2.在50ng/ml rspo1组与空白对照组两组之间,使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶、Elisa试剂盒检测骨保护素,rspo1组可上调碱性磷酸酶活性、促进骨保护素的分泌,进行方差分析,两组之间有显著性差异,Prspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间,同样检测碱性磷酸酶、骨保护素,两两之间进行分析。50ng/ml rspo1组与空白对照组比较,结果同结果2一样;50ng/ml Wnt3a组与空白组比较,两组之间有显著性差异,P1;50ng/ml Wnt3a组与50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a比较,两组之间有显著性差异,P1。4.检测被浓度递增的rspo1、Wnt3a及两者共刺激处理下细胞的报告基因活性,根据绘制曲线图,可发现rspo1对TCF报告质粒激活作用不明显;Wnt3a可激活TCF报告质粒,并且呈剂量依赖性;rspo1和Wnt3a联合则有协同叠加作用。5.对50ng/ml rspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间胞内的β-catenin进行Western Blot检测,根据蛋白电泳条带颜色从深到浅排列顺序为50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1组、空白对照组;50ng/ml rspo1组与空白对照组比较,蛋白条带颜色稍深、柱状图稍高,但两组之间无显著性差异,P>0.05;50ng/ml Wnt3a组与空白对照组比较,有显著性差异,Prspo1+50ng/ml Wnt3a组与50ng/ml Wnt3a组比较,有显

关键词：类风湿关节炎 Wnt/β-catenin信号通路 rspo1 Wnt3A C2C12细胞

rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

Rspo1通过Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞分化

作者：彭杨茜子第二军医大学

学位级别：硕士

类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。其病理特点是关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成。研究表明，Wnt信号通路同类风湿关节炎引起的骨代谢改变有着密切的联系，在类风湿关节炎患者病情发展中，Wnt信号途径受... 详细信息

类风湿关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的全身性自身免疫病。其病理特点是关节滑膜的慢性炎症、血管翳形成。研究表明，Wnt信号通路同类风湿关节炎引起的骨代谢改变有着密切的联系，在类风湿关节炎患者病情发展中，Wnt信号途径受抑，进而抑制了成骨细胞增殖、分化，促进了骨质疏松、骨质侵蚀的发展。近几年，rspo1（R-脊椎蛋白1）作为Wnt信号通路的激活剂被研究甚多，但不清楚它能否通过激活Wnt信号通路作用于成骨细胞。目前尚无有效的措施来改善和延缓类风湿关节炎骨侵蚀病情的进展，明确其骨侵蚀发生机制可为类风湿关节炎骨侵蚀的临床治疗提供科学依据。一、研究目的本实验通过构建含有TCF荧光素酶报告基因的C2C12细胞，检测其在rspo1、Wnt-3a等刺激下，骨保护素、碱性磷酸酶及胞内β-catenin蛋白含量的变化，以研究rspo1是否通过Wnt信号通路来促进成骨细胞分化，从而为防治类风湿关节炎骨侵蚀增添新理论和新手段。二、研究方法采用DMEM培养基对C2C12细胞进行原代培养和传代培养。将扩增了的C2C12细胞进行计数，以4×104/ml的浓度加入48孔培养基中继续培养备用。首先，采用Roche公司xCELLIgence技术的细胞动力学模型分析系统，研究rspo1及Wnt3a对C2C12细胞增殖的影响。其次，应用Lipofectamine2000将TCF报告质粒及pRL-SV40报告质粒共转染入C2C12细胞，继续培养。接着，我们通过检测骨成熟标志物碱性磷酸酶、骨保护素来验证rspo1对C2C12细胞的作用。处理组细胞加入50ng/ml的rspo1刺激因子，空白对照组为空，采用ELASA检测法，收集各组细胞上清液测骨保护素水平，裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平。随后增加了50ng/ml Wnt3a组和50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组，同样采用ELASA检测法，收集各组细胞上清液测骨保护素水平，裂解各组细胞测胞内碱性磷酸酶水平，并采用SPSS17.0统计软件对数据进行方差分析。β-catenin蛋白是Wnt信号通路中的关键蛋白，其进入核内后可与TCF质粒相结合，从而激活下游靶基因的转录。通过对TCF荧光素酶报告基因和β-catenin蛋白的检测可反应Wnt信号通路的激活状态。接着， C2C12细胞转染入TCF报告质粒及pRL-SV40报告质粒6h后，更换含不同浓度的rspo1、Wnt3a及两者都有的新鲜完全培养基，24h后应用Promega公司的双荧光素酶报告基因检测系统检测报告基因转录活性。最后，我们对50ng/mlrspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组细胞的β-catenin蛋白进行Western blot检测，并进行统计学分析。三、结果 1. xCELLIgence系统检测显示rspo1对C2C12细胞增殖没有影响，Wnt3a对C2C12细胞增殖有促进作用。 2.在50ng/ml rspo1组与空白对照组两组之间，使用碱性磷酸酶检测试剂盒检测碱性磷酸酶、 Elisa试剂盒检测骨保护素，rspo1组可上调碱性磷酸酶活性、促进骨保护素的分泌，进行方差分析，两组之间有显著性差异，P＜0.05，具有统计学意义。 3.在50ng/mlrspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间，同样检测碱性磷酸酶、骨保护素，两两之间进行分析。50ng/ml rspo1组与空白对照组比较，结果同结果2一样;50ng/ml Wnt3a组与空白组比较，两组之间有显著性差异，P＜0.01;50ng/ml Wnt3a组与50ng/mlrspo1+50ng/ml Wnt3a比较，两组之间有显著性差异，P＜0.01。 4.检测被浓度递增的rspo1、Wnt3a及两者共刺激处理下细胞的报告基因活性，根据绘制曲线图，可发现rspo1对TCF报告质粒激活作用不明显;Wnt3a可激活TCF报告质粒，并且呈剂量依赖性;rspo1和Wnt3a联合则有协同作用。 5.对50ng/mlrspo1组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组以及空白对照组四组之间胞内的β-catenin进行Western Blot检测，根据蛋白电泳条带颜色从深到浅排列顺序为50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组、50ng/ml Wnt3a组、50ng/mlrspo1组、空白对照组;50ng/mlrspo1组与空白对照组比较，蛋白条带颜色稍深、柱状图稍高，但两组之间无显著性差异，P＞0.05;50ng/ml Wnt3a组与空白对照组比较，有显著性差异，P＜0.05;50ng/ml rspo1+50ng/ml Wnt3a组与50ng/mlWnt3a组比较，有显

关键词：类风湿关节炎 Wnt/β-catenin信号通路 rspo1 Wnt3A C2C12细胞