检索结果-南通市图书馆

作者：赵旻磊锦州医科大学

学位级别：硕士

目的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要病原体,龈上菌斑的定植是P.gingivalis造成慢性牙周炎发生和发展的第一步。临床上慢性牙周炎患者常伴有不同程度的龋齿,变异链球菌(Streptococcus mutans,... 详细信息

目的牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是慢性牙周炎的主要病原体,龈上菌斑的定植是P.gingivalis造成慢性牙周炎发生和发展的第一步。临床上慢性牙周炎患者常伴有不同程度的龋齿,变异链球菌(Streptococcus mutans,S.mutans)RNC基因缺失株能够降低龋齿的发生,同时作为口腔早期定植菌可有效降低自身生物膜的形成及抑制生物膜中异种微生物的生存。因此,我们通过构建P.gingivalis菌毛(FimAⅣ)和牙龈素(rgpa)基因缺失株及S.mutans RNC基因缺失株,为探究S.mutans RNC基因缺失株对P.gingivalis生物膜形成能力的影响,揭示RNC基因缺失株抑制P.gingivalis黏附宿主细胞的机制,为RNC基因缺失株用于P.gingivalis相关疾病的预防和治疗应用提供实验依据。方法1.设计扩增FimAⅣ和rgpa基因上下游同源臂,红霉素抗性基因的PCR引物,采用PCR扩增重组DNA片段以电转化的方式对P.gingivalis W83菌株的FimAⅣ与rgpa基因进行全序列敲除。同时,采用q PCR检测野生株,FimAⅣ和rgpa缺失株粘附相关基因表达水平。2.设计扩增RNC基因上下游同源臂,Kana抗性基因的PCR引物,采用PCR扩增重组DNA片段通过自然转化法同时加入S.mutans刺激多肽(CSP)对S.mutans 25172菌株的RNC基因进行敲除。3.S.mutans与P.gingivalis共培养,分析P.gingivalis生物膜形成能力的变化:将不同终浓度的S.mutans(25175野生株和RNC基因突变株)菌体和上清液与终浓度为1x108CFU/m L P.gingivalis(W83野生株,FimAⅣ和rgpa基因突变株)共同厌氧培养72h后,通过结晶紫染色和FITC染色检测P.gingivalis生物膜形成情况。4.S.mutans对P.gingivalis黏附人牙周膜成纤维细胞(HPDLF)能力的影响:将终浓度为1x108CFU/m L的S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)菌体和上清与P.gingivalis W83(野生株,FimAⅣ和rgpa基因突变株)共同感染HPDLF细胞1h后,通过q PCR检测P.gingivalis对HPDLF的黏附率。5.S.mutans上清液对P.gingivalis FimAⅣ和rgpa基因m RNA表达水平的影响:将108CFU/m L的S.mutans上清与P.gingivalis W83(野生株,FimAⅣ和rgpa基因突变株)共同感染HPDLF细胞3h后,通过q PCR检测与粘附相关的FimA和rgpa m RNA表达水平。同时,检测蛋白酶R活性情况。结果1.P.gingivalis W83(FimAⅣ和rgpa)和S.mutans 25175(RNC)基因突变株构建成功并得到P.gingivalis W83细菌株最适电转化条件:OD600为0.6,电转化片段1.0μg,电转缓冲液为EP缓冲液,最适电压为2.5kv,最佳转化效率为4.8x104CFU/μg DNA。2.结晶紫染色和FITC染色检测结果显示S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)均有效降低P.gingivalis W83生物膜的形成(Prgpa基因突变株)对细胞的黏附(P0.05)4.S.mutans 25175(野生株和RNC基因突变株)上清液降低P.gingivalis的FimAⅣ和rgpa的基因表达水平而提高牙龈素R的活性。结论1.RNC基因突变株相较于S.mutans野生株对P.gingivalis W83生物膜的形成抑制作用更强。2.RNC基因突变株上清液相较于菌体本身能够更有效的降低P.gingivalis W83的菌毛蛋白FimAⅣ和牙龈素rgpa的基因表达水平从而抑制P.gingivalis对HPDLF的黏附能力。3.S.mutans主要作用于P.gingivalis W83的长菌毛(FimAⅣ)从而降低P.gingivalis W83对细胞黏附能力。

关键词：牙龈卟啉单胞菌变异链球菌 HPDLF RNC rgpa FimAⅣ

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DNA疫苗pVAX1-rgpa、pVAX1-IL-4预防牙周炎的实验研究

DNA疫苗pVAX1-rgpA、pVAX1-IL-4预防牙周炎的实验研究

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作者：郑雪山东大学

学位级别：硕士

目的：牙周炎是一种发生在牙周支持组织的感染性疾病,到目前为止,其在世界范围内均有较高的发生率,也是导致牙齿丧失的主要原因之一。牙龈卟啉单胞国(Porphyromonas gingivalis,P.g)是目前公认的牙周致病菌。牙龈素(gingipains)是由Pg... 详细信息

目的：牙周炎是一种发生在牙周支持组织的感染性疾病,到目前为止,其在世界范围内均有较高的发生率,也是导致牙齿丧失的主要原因之一。牙龈卟啉单胞国(Porphyromonas gingivalis,P.g)是目前公认的牙周致病菌。牙龈素(gingipains)是由Pg分泌的存在于Pg外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶,包括精氨酸-牙龈素(Arginine-gingipains,Rgps)和赖氨酸-牙龈素(Lysine-gingipain,Kgp)。精氨酸牙龈素A是破坏宿主组织的重要毒力因子,并且牙龈卟啉单胞菌在牙周组织的粘附定植、侵袭破坏宿主细胞、影响机体免疫平衡等方面发挥着重要作用,同时还具有良好的免疫原性。白细胞介素4促进th0细胞向th2细胞分化,进而活化B细胞,促进机体的体液免疫。本实验旨在构建牙龈卟啉单胞菌精氨酸牙龈素A和人白细胞介素4真核表达质粒,作为基因疫苗注射到大鼠体内,促进其产生牙龈卟啉单胞菌的特异性抗体,同时产生细胞因子白细胞介素4,联合发挥预防牙周炎的作用。方法： 1通过聚合酶链式反应PCR)扩增基因rgpa和IL-4,将其各自插入真核质粒pVAX-1,构建重组质粒pVAX1-rgpa、pVAX1-IL-4. 2将32只大鼠随机分为A、B、C、D4组,分别采用肌肉注射法给予基因疫苗TEbuffer、pVAX1、pVAX1-rgpa、pVAX1-rgpa+pVAXl-IL-4. 3建立实验性牙周炎模型。 4记录各组牙周状况,收集血液样本,采用ELISA方法分别检测血清中IgG的抗体水平。 5统计学分析结果：本实验成功构建真核表达质粒pVAX1-rgpa和pVAX1-IL-4。Elisa结果显示：C组IgG水平明显高于(Prgpa作为DNA疫苗能够诱导机体产生特异性抗体对抗Pg;联合应用pVAXl-IL-4能够增强疫苗的免疫活性,是有效的免疫佐剂;因此高效DNA疫苗pVAXl-rgpa和pVAXl-IL-4能够有效地减缓牙周炎发生和发展,是有潜力的抗牙周炎疫苗。

关键词：牙周炎 rgpa IL-4 DNA疫苗

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牙龈卟啉单胞菌蛋白酶基因rgpa与rgpB催化结构域的克隆和表达

牙龈卟啉单胞菌蛋白酶基因rgpA与rgpB催化结构域的克隆和表达

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作者：石卓瑾浙江大学

学位级别：硕士

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）rgpa、rgpB催化结构域,构建rgpa、rgpB催化结构域原核表达系统。方法:采用聚合酶链式反应（PCR）从Pg ATCC 33277菌株中扩增rgpa、rgpB催化结构域,T-A克隆后测定核苷酸序... 详细信息

目的:克隆牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis,Pg）rgpa、rgpB催化结构域,构建rgpa、rgpB催化结构域原核表达系统。方法:采用聚合酶链式反应（PCR）从Pg ATCC 33277菌株中扩增rgpa、rgpB催化结构域,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpa/rgpB催化结构域表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果:所克隆的Pg ATCC 33277菌株rgpa、rgpB基因催化结构域的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpa/rgp B-BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论:本研究成功地构建了Pg rgpa、rgpB催化结构域高效表达系统,为测定rgpa、RgpB免疫原性及作用提供前提。

关键词：牙龈卟啉单胞菌 rgpa rgpB 牙龈素

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牙龈卟啉菌蛋白酶基因rgpa与rgpB蛋白酶区的克隆和表达

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口腔医学 2008年第7期28卷 340-342,346页

作者：石卓瑾严杰陈莉丽浙江大学医学院附属第二医院口腔科杭州310009 浙江大学医学院病原微生物学教研室杭州310058

目的克隆牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)rgpa、rgpB蛋白酶区,构建rgpa、rgpB蛋白酶区原核表达系统。方法采用聚合酶链式反应(PCR)从PgATCC33277菌株中扩增rgpa、rgpB蛋白酶区,T-A克隆后测定核苷酸序列,构建pET42a的rgpa/rgpB蛋白酶区表达载体,在E.coli BL21DE3宿主菌中用不同浓度的IPTG诱导其表达。结果所克隆的PgATCC33277菌株rgpa、rgpB基因蛋白酶区的核苷酸序列与报道的相应核苷酸序列同源性分别为98.9%、99.0%,氨基酸序列同源性分别高达99.2%、99.1%。pET42a-rgpa/rgpB-E.coli BL21DE3系统的蛋白表达量为细菌总蛋白的60%左右。结论本研究成功地构建Pgrgpa、rgpB蛋白酶区高效表达系统,为测定rgpa、RgpB免疫原性及作用提供前提。

关键词：牙龈卟啉单胞菌 rgpa rgpB 牙龈素

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