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repsox和LBH589联合处理对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响

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RepSox和LBH589联合处理对猪体细胞克隆胚胎体外发育的影响

作者：罗肇博延边大学

学位级别：硕士

体细胞核移植胚胎在体外发育时,因为供体细胞核过低多能性及异常表观重编程而出现胚胎发育阻滞现象。继而导致体细胞克隆胚胎发育异常和哺乳动物体细胞核移植效率低下。目前关于同时提高胚胎发育的多能性和表观遗重编程能力少有研究。Re... 详细信息

体细胞核移植胚胎在体外发育时,因为供体细胞核过低多能性及异常表观重编程而出现胚胎发育阻滞现象。继而导致体细胞克隆胚胎发育异常和哺乳动物体细胞核移植效率低下。目前关于同时提高胚胎发育的多能性和表观遗重编程能力少有研究。repsox是在诱导多能干细胞中发现的一种可以促进细胞产生多能性的小分子化合物。本实验的目的是结合repsox和组蛋白去乙酰化抑制剂处理猪体细胞克隆胚胎,提高胚胎发育多能性的同时又改善表观遗传修饰,从而提高猪体细胞克隆胚胎体外发育能力及克隆效率。通过分析早期胚胎体外发育能力筛选出最佳的去乙酰化抑制剂及repsox的最佳处理浓度。通过检测早期胚胎不同发育时期多能性基因的表达情况,分析胚胎发育的全能性;通过免疫荧光染色检测早期胚胎乙酰化和甲基化水平,判断其表观重编程能力;并通过凋亡染色确定胚胎质量。本实验得到以下分析结果:1.50nmol/LLBH589处理24小时组体外发育能力显著高于5 μmoI/LM344处理6小时组、0.2μmol/L MGCD0103处理6小时组、2mmol/L VPA处理24小时组和对照组(Prepsox处理猪体细胞克隆胚胎,12.5、25 μmol/L组2-细胞率、4-细胞率、囊胚率、囊胚平均细胞数和对照组没有显著性差异,但显著高于50、100μmol/L 处理组(Prepsox和50 nmol/L LBH589共处理胚胎体外发育能力显著高于对照组,多能性基因NANOG、POU5FI、SOX2表达量在4-细胞期、囊胚期显著高于对照组和LBH589处理组,且共处理组表观重编程水平优于对照组和LBH589处理组。结论:repsox和LBH589共处理可以提高猪体细胞克隆胚胎早期发育能力和胚胎质量,提高多能性基因的表达及表观重编程水平。

关键词：体细胞核移植表观遗传 repsox 多能性 LBH589

repsox对牛骨髓间充质干细胞增殖和分化潜能的影响

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Repsox对牛骨髓间充质干细胞增殖和分化潜能的影响

作者：赵欣欣吉林大学

学位级别：硕士

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是广泛存在于骨组织内的多潜能成体干细胞,具有较强的自我更新和多向分化潜能,在干细胞研究中具有重要作用。自BMSCs被发现以来,在人和小鼠中已开展了大量研究,其体外分离... 详细信息

骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)是广泛存在于骨组织内的多潜能成体干细胞,具有较强的自我更新和多向分化潜能,在干细胞研究中具有重要作用。自BMSCs被发现以来,在人和小鼠中已开展了大量研究,其体外分离、纯化、培养体系已基本建立。而在大动物如牛中,关于BMSCs的研究相对较少,在体外培养、表型鉴定方面仍存有争议,在其体外培养过程中,随传代次数的增多,细胞增殖能力会逐渐减退,伴随而来的还有细胞衰老、多能性丢失等诸多问题。本试验针对以上问题,首先通过全骨髓细胞分离、血细胞裂解以及贴壁纯化培养的方法分离得到胎牛骨髓间充质干细胞(bovine BMSCs,bBMSCs),并通过免疫染色、流式鉴定、多向诱导分化等方法验证其生物学特性。结果显示,分离得到的细胞确为bBMSCs,有较强的克隆增殖能力;免疫荧光染色结果显示bBMSCs能够表达间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)相关阳性标记分子CD73、CD90、CD105,同时不表达阴性标记分子CD34、CD45,且流式细胞分析进一步确证其纯度可达90%以上;诱导分化实验结果证明bBMSCs具有较强多向分化潜能。为优化bBMSCs体外培养条件,本研究通过改变基础培养基中的胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)和血清替代物(knockout serum replacement,KSR)浓度,设定了四种FBS-KSR组合培养基。通过测定不同浓度FBS-KSR组合条件下细胞的增殖水平证明,降低FBS并添加KSR有利于bBMSCs的体外增殖,适当浓度FBS-KSR可提高bBMSCs增殖相关基因的表达。此外,KSR还可促进抗凋亡基因Bcl2及多能性基因Oct4、Sox2的表达。值得注意的是,当完全去除FBS而以KSR替代时,bBMSCs的增殖会发生停滞。以上结果说明KSR可以提高bBMSCs体外增殖及多潜能性,但由于FBS中可能存在某种尚不明确的bBMSCs增殖所必需的成分,因而KSR并不能完全取代FBS。有研究表明,repsox作为TGF-β受体ALK5的选择性抑制剂,在多能干细胞的诱导和多能性维持方面至关重要。对于bBMSCs而言,repsox能否优化其干细胞特性,提高细胞增殖及多能性尚未见报道。本试验发现repsox处理后,bBMSCs增殖基因、多能性基因表达水平均发生显著上调,成骨分化潜能显著提高,而成软骨分化潜能显著降低。本研究通过对bBMSCs进行分离鉴定、体外培养、培养条件优化,确定了bBMSCs的生物学特性和添加KSR的优化培养效果;进一步利用repsox处理细胞,探究其对bBMSCs增殖及多能性的影响,旨在为bBMSCs的体外培养体系优化、干细胞特性研究及重编程诱导机制探究等方面提供一定借鉴,为其进一步的应用奠定基础。

关键词：牛骨髓间充质干细胞培养 repsox 增殖分化

repsox对人胚胎干细胞分化为肝细胞的影响

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广东药科大学学报 2020年第1期36卷 84-88页

作者：李秋鸿卢嘉怡广东药科大学生命科学与生物制药学院

目的在肝细胞诱导分化后期加入repsox,探究其对肝细胞分化效率的影响。方法在人胚胎干细胞定向诱导为肝细胞过程中,从分化第13天开始,在实验组中添加repsox,对照组中加入等量的DMSO,收集分化至第21天的细胞样品和培养液上清进行检测。... 详细信息

目的在肝细胞诱导分化后期加入repsox,探究其对肝细胞分化效率的影响。方法在人胚胎干细胞定向诱导为肝细胞过程中,从分化第13天开始,在实验组中添加repsox,对照组中加入等量的DMSO,收集分化至第21天的细胞样品和培养液上清进行检测。通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和酶联免疫吸附(ELISA)测定整个分化过程中TGFβ1的表达量和分泌量变化;测定对照组与实验组细胞中TGFβ1分泌量、白蛋白(albumin)分泌量和尿素(urea)合成量。结果在整个肝细胞分化过程中,TGFβ1先明显上调然后逐渐下调;加入repsox后,TGFβ1后期下调更为显著。实验组表达白蛋白的细胞数量多于对照组,其白蛋白分泌量以及尿素合成量也明显高于对照组(Prepsox能够有效促进人多能干细胞转变为肝细胞。

关键词：人多能干细胞 repsox 肝细胞 albumin TGFβ1

X射线辐照后人血管内皮细胞ALK5表达变化研究

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X射线辐照后人血管内皮细胞ALK5表达变化研究

作者：冯俊博新疆医科大学

学位级别：硕士

目的:研究X射线辐照后24小时人血管内皮细胞激活素受体样激酶5（ALK5）及其下游p-Smad2、p-Smad3表达情况、repsox对ALK5及其所在信号通路的抑制作用以及辐照后血管内皮细胞激活素受体样激酶1（ALK1）的表达情况。方法:分为对照组（Cont... 详细信息

目的:研究X射线辐照后24小时人血管内皮细胞激活素受体样激酶5（ALK5）及其下游p-Smad2、p-Smad3表达情况、repsox对ALK5及其所在信号通路的抑制作用以及辐照后血管内皮细胞激活素受体样激酶1（ALK1）的表达情况。方法:分为对照组（Control）、辐照组（IR）和repsox干预组（IR+repsox）。使用X射线对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行照射,于辐照后24小时分别检测细胞增殖情况、细胞ALK5、Smad2、Smad3、ALK1 m RNA表达、ALK5、p-Smad 2、p-Smad3蛋白表达以及使用repsox进行干预后对上述指标的影响。结果:辐照后24小时辐照组血管内皮细胞数量低于对照组,ALK5 m RNA和蛋白表达量较对照组分别上调了56.2%和113%;Smad2 m RNA表达量较对照组上调了86%,Smad3 m RNA表达量较对照组上调了79.5%;p-Smad2蛋白表达量较对照组上调了194%,p-Smad3蛋白表达量较对照组上调了194%。repsox干预后,repsox干预组（1μmol/L）细胞数量高于辐照组,repsox干预组（1μmol/L）ALK5 m RNA和蛋白表达量较辐照组分别下调了29.1%和35.6%;Smad2 m RNA表达量较辐照组下调了29.7%,Smad3 m RNA表达量较辐照组下调了17.1%;p-Smad 2蛋白表达量较辐照组下调了13.6%,p-Smad3蛋白表达量较辐照组下调了13.6%。ALK1 m RNA表达量较对照组下调了32.7%。结论:辐照可以导致血管内皮细胞ALK5及其下游基因表达上调,ALK1表达量有可能下调,使用repsox（1μmol/L）可以有效抑制ALK5及其下游基因表达,降低辐照对血管内皮细胞的损伤。

关键词：辐照血管内皮细胞 ALK1 ALK5 repsox