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微生物学报 2017年第11期57卷 1735-1746页

作者：郑文韬张友明卞小莹山东大学亥姆霍兹生物技术研究所微生物技术国家重点实验室山东大学生命科学学院山东青岛266237

red/et同源重组技术(red/et recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对redα/redβ或来源于Rac原噬菌体的蛋白对Rec E/Rec T所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术,能对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操... 详细信息

red/et同源重组技术(red/et recombineering)是由来源于大肠杆菌λ噬菌体的蛋白对redα/redβ或来源于Rac原噬菌体的蛋白对Rec E/Rec T所介导的基于短同源臂(40–50 bp)的同源重组技术,能对宿主DNA序列进行快速、高效、精确的修饰和操作。本文主要综述了2010年以来red/et同源重组技术在大肠杆菌及其他细菌中的研究进展,同时简要介绍了该技术在微生物基因组挖掘,尤其是在微生物基因簇的异源表达领域的应用进展。

关键词： red/et同源重组技术直接克隆遗传工程基因组挖掘次级代谢产物异源表达

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发光杆菌mcf杀虫基因的克隆和功能研究

发光杆菌mcf杀虫基因的克隆和功能研究

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作者：谭思维湖南师范大学

学位级别：硕士

昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含两个属致病杆菌属(***)和发光杆菌属(Pho torhabdus. spp),分别与斯氏线虫属(Steinernematide)和异小杆属(He terorhabdi tidae)的病原线虫互惠共生。已有的研究表明共生菌不仅能产... 详细信息

昆虫病原线虫共生菌属于肠杆菌科、革兰氏阴性菌,包含两个属致病杆菌属(***)和发光杆菌属(Pho torhabdus. spp),分别与斯氏线虫属(Steinernematide)和异小杆属(He terorhabdi tidae)的病原线虫互惠共生。已有的研究表明共生菌不仅能产生血腔毒素,同时还能产生胃毒素。Daborn等从发光杆菌属(P. luminescens subsp. akhurstii strain W14)中发现了(make caterpillars floppy)致软因子——Mcf毒素,实验数据表明Mcf毒素通过促使昆虫血细胞和中肠上皮细胞凋亡,来破坏免疫反应达到自身的存活,同时破坏肠道,使昆虫上皮细胞组织渗透压失调,软弱无力最后死亡。本研究将通过基因重组技术手段异源表达有活性的Mcf毒素用于害虫防治。通过同源性比对分析,在Mcf氨基酸序列中N端有一个BH3结构域,拥有BH3结构域的蛋白具有使细胞凋亡功能,推测保留N端BH3结构域的C-端截短Mcf毒素具有杀虫毒力。从发光杆菌属中克隆了杀虫毒素基因mcf的5’端3 960 bp的核酸序列(包含BH3结构域),将该基因连接到***表达载体pet28a上,并转入BL21(DE3)。经IPTG诱导后,经SDS-PAGE检测发现,产生145 kDa的目的蛋白质。提取包涵体得到毒素,分别对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)初龄幼虫喂食生测和对甜菜夜蛾四龄幼虫注射生测,显示该毒素具有喂食毒力和血腔毒力,证明含有BH3区域的C-端截短Mcf毒素在大肠杆菌中表达有杀虫活性。利用cry1Ac的启动子启动mcf基因在无晶体突变株Cry-B中表达,通过red／et同源重组技术构建表达载体pHT1AcPTMcf,将表达载体pHT1AcPTMcf电转Cry-B.在Cry-B中表达C-端截短Mcf毒素,通过SDS-PAGE和Western blotting检测鉴定,工程菌Cry-B(pHT1AcPTMcf)表达了C-端截短Mcf毒素。通过对甜菜夜蛾初龄幼虫进行生物活性测定,显示该毒素具有喂食毒力,证明含有BH3区域的C-端截短Mcf毒素在Cry-B中表达有杀虫的生物活性。本研究在成功异源表达了有活性的C-端截短Mcf毒素,对研制高效、广谱、安全的杀虫剂,克服害虫对生物杀虫剂易产生抗性问题提供了新的技术途径。

关键词：发光杆菌 mcf基因 red/et同源重组技术 SDS-PAGE Western-blotting 生测

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苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功能研究

苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功...

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作者：曾智湖南师范大学

学位级别：硕士

为了构建杀虫毒力高和杀虫谱广的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)工程菌株,利用本研究室筛选的Bt高毒力菌株Bt4.0718(CCTCC No.200016)中的cry1Ac基因和在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中新发现的类枯草杆菌蛋白酶CDEP... 详细信息

为了构建杀虫毒力高和杀虫谱广的苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,简称Bt)工程菌株,利用本研究室筛选的Bt高毒力菌株Bt4.0718(CCTCC No.200016)中的cry1Ac基因和在球孢白僵菌(Beauveria bassiana)中新发现的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因构建融合基因和表达融合蛋白来提高Bt晶体蛋白的杀虫毒力。根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出本研究室保存的球孢白僵菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列。经过比较后发现该基因是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因家族的新成员(GenBank登录号:EF195164)。该基因中1137bp的开放阅读框编码一个含379个氨基酸、分子量为38.8KDa、pI=8.21的蛋白酶前体。将CDEP2基因的cDNA序列连接到融合表达载体pet28a(+)的多克隆位点,构建重组质粒并转化到大肠杆菌(***)BL21菌株中。将经过IPTG诱导后的重组菌株进行SDS-PAGE检测,结果表达了42KD的(His)-CDEP2蛋白。将纯化后的CDEP2蛋白来免疫新西兰公兔,制备了该蛋白的多克隆抗体。以本研究室已经成功构建好的重组质粒pHT-cry1Ac-HwtxⅪ作为靶标质粒,通过red/et同源重组技术,将其中的蜘蛛蛋白酶抑制剂基因(HwtxⅪ)重组替换成CDEP2基因,构建新的重组质粒pHT-cry1Ac-CDEP2。将该重组质粒电转化到Bt无晶体突变株Cry-B中,构建新的重组工程菌株CryB-pHT-cry1Ac-CDEP2。SDS-PAGE和Western blot检测证明融合蛋白在重组菌株中得到表达。对CryB-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株和CryB-pHT-cry1Ac菌株研究比较发现,前者形成晶体所需时间明显比后者缩短,晶体蛋白表达量明显增加。生测结果表明CryB-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株发酵液对棉铃虫(Helicoverpa armigera)三龄幼虫有高效杀虫活性,生测72h后的LC值为8.50μl/ml,比对照菌株CryB-pHT-cry1Ac降低了49.1%。本研究首次将杀虫真菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因与Btcry1Ac基因融合,并使其在Bt中融合表达,为拓宽Bt杀虫谱、提高杀虫毒力和延缓害虫对Bt产生抗性等研究提供了基础。red/et同源重组技术为Bt cry基因和其它外源毒素基因的融合以及构建高毒力的Bt工程菌株提供了一个全新的分子生物学技术平台。

关键词：苏云金芽胞杆菌球孢白僵菌 cry1Ac基因 CDEP2基因 red/et同源重组技术 Western blot

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表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒构建及应用

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中国动物检疫 2024年第9期41卷 122-128页

作者：宋新宇张茜贡鑫戚亭陈雨车艳杰天津瑞普生物技术股份有限公司天津300308

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用red/et同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT... 详细信息

为构建表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组火鸡疱疹病毒(herpesvirusofturkey,HVT),以连续覆盖HVT全基因组的Fosmid文库为基础,利用red/et同源重组技术和Gateway LR克隆技术,将优化的携带Pec复合启动子的HA基因插入到HVT复制非必需区HVT053与HVT054位点处的95318~95319nt之间,获得了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组HVT(rHVT-H9-HA株),并对构建的毒株进行鉴定。结果显示,成功构建了含有HA基因的入门质粒pEntr-HA,通过Gateway克隆的LR反应将含有HA基因的表达盒转移到黏粒pFosC DEST的第53和54号基因之间形成pFosC HA;提取5个黏粒后,转染次代CEF细胞获得拯救重组病毒rHVT-H9-HA株。连续传代和动物试验结果表明,rHVT-H9-HA株毒价高,遗传稳定,可以克服母源抗体干扰,免疫持续期长,能够提供针对H9亚型禽流感的保护;同时也实现了一针防两病,效果明显优于灭活疫苗。本研究为H9亚型禽流感病毒重组HVT活载体疫苗的研制提供了技术支撑。

关键词：重组毒株rHVT-H9-HA 火鸡疱疹病毒 HA基因 red/et同源重组技术 GatewayLR克隆技术

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