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作者：侯菁中南民族大学

学位级别：硕士

白血病是一类造血系统中的恶性肿瘤疾病,在青少年癌症发病率中最高。白血病分型较多、发病机制较为复杂,且白血病细胞极易快速转移而导致治疗失败。因此,深入研究白血病发生发展的分子机制,寻找有效治疗靶标,为白血病治疗提供新的策略,... 详细信息

白血病是一类造血系统中的恶性肿瘤疾病,在青少年癌症发病率中最高。白血病分型较多、发病机制较为复杂,且白血病细胞极易快速转移而导致治疗失败。因此,深入研究白血病发生发展的分子机制,寻找有效治疗靶标,为白血病治疗提供新的策略,具有重要的临床意义和社会价值。Werner(WRN)DNA解旋酶是recq家族解旋酶的重要成员,在DNA复制、转录、修复及端粒稳定性维持中具有重要的作用,对于维持基因组完整性和细胞稳态至关重要,其机制主要涉及WRN对DNA损伤修复。WRN基因功能异常会导致人类早衰综合征,易患各种癌症,但其在癌症生物学中的功能尚不清楚。本论文首先研究recq家族解旋酶在不同类型的白血病细胞的表达,筛选WRN高表达的白血病细胞株构建WRN缺失的细胞株,研究WRN弱表达对白血病细胞生长、周期、分化、衰老等发生与发展过程的影响,并结合转录组学及其分子生物学技术研究其分子机制,解析WRN对白血病发生与发展调控的分子机制。首先,研究五种人类recq解旋酶在不同类型白血病细胞中的表达。采用RT-PCR及q RT-PCR检测6种白血病细胞K562(慢性髓系白血病细胞)、HEL(人红白血病细胞)、CCRF-CEM(人急性T淋巴细胞白血病细胞)、Jurkat(人急性T淋巴细胞白血病细胞)、THP-1(人急性单核细胞白血病细胞)、Raji(人淋巴瘤细胞)中五种recq解旋酶成员(WRN、BLM、recqL1、recq4和recq5)在转录水平的表达。Western Blot检测上述细胞中五种recq解旋酶成员在蛋白水平的表达。RT-PCR实验结果发现:WRN在K562、HEL及Raji细胞中的表达水平较高(precqL1在Raji细胞中表达水平最高,CCRF-CEM细胞中最低,在另4种细胞中表达无差异;recq4在6种细胞株中表达水平均较高,且无明显差异;recq5在6种白血病细胞中未检测到表达;Western Blot检测结果发现:WRN蛋白在K562细胞中表达水平最高,在HEL、Raji及THP-1细胞中表达较低,在另外2种人急性T淋巴白血病细胞中未检测到其表达;BLM蛋白在K562、HEL及Raji细胞中发现有较低水平的表达,在另3种细胞中未检测到其表达;recqL1蛋白表达水平在HEL、CCRF-CEM及THP-1细胞中较高,在另外3种细胞中较低;recq4蛋白表达水平与转录水平结果一致;recq5蛋白在6种白血病细胞中未检测到表达。通过转录水平及蛋白水平结果综合分析发现,与其他4种解旋酶相比,WRN解旋酶在6中白血病细胞中表达水平差异明显(p解旋酶表达水平最高。因此,后续实验选择K562细胞为研究模型,WRN基因为研究对象。其次,研究WRN解旋酶弱表达对K562细胞增殖、周期、分化、衰老的影响。通过构建短发夹RNA(sh RNA)干扰WRN蛋白表达的目的载体及空载体,使用慢病毒包装系统将载体稳定转染到K562细胞,通过嘌呤霉素筛选出WRN稳定弱表达的K562细胞及转染空载体的K562细胞。使用q RT-PCR及Western blot检测转染后的K562细胞中WRN表达水平;采用CCK8细胞增殖实验、细胞克隆形成实验检测WRN弱表达对K562细胞生长的影响,用流式细胞术检测细胞周期、细胞分化的变化,通过Western blot实验检测细胞周期相关蛋白的表达变化,采用细胞衰老染色试剂盒检测细胞衰老情况。q RT-PCR实验结果表明:与未转染得K562细胞相比,转染目的载体的K562细胞中WRN基因或蛋白表达水平显著降低(p<0.01),转染空载体的K562细胞中WRN基因表达水平无明显差异。Western blot实验结果与q RT-PCR实验结果一致,表明WRN蛋白稳定低表达的K562细胞构建成功;细胞增殖实验及细胞克隆形成实验结果发现,与对照组相比,WRN弱表达对K562细胞增殖及生长有显著的抑制作用(p<0.01);流式细胞术结果发现:与对照组相比,WRN弱表达可阻滞K562细胞周期在G2/M期(p<0.05),WRN弱表达不影响K562细胞红系分化;Western blot实验结果发现:与对照组相比,WRN弱表达的K562细胞中G2/M期标志蛋白CDC2、Cyclin B1蛋白表达水平显著降低(p<0.01),表明WRN弱表达可能通过调控CDC2、Cyclin B1蛋白表达阻滞K562细胞周期在G2/M期;细胞衰老染色结果发现:与对照组相比,WRN弱表达可显著促进K562细胞衰老(p<0.01)。然后,研究WRN弱表达影响K562细胞对DNA损伤诱导剂Etoposid

关键词：白血病 recq解旋酶 WRN解旋酶细胞衰老 DNA损伤信号通路转录组学

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丙酸睾酮对大肠杆菌recq解旋酶结构和功能的影响

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中国药理学通报 2011年第4期27卷 467-472页

作者：段丽霞许厚强陈祥骆衡贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖人才基地贵州大学动物科学学院教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室贵州山地农业病虫害重点实验室贵州贵阳550025

目的研究体外丙酸睾酮对大肠杆菌recq解旋酶结构和功能的影响及二者的相互作用机制。方法分别运用荧光偏振技术、ATPase试剂盒和紫外吸收光谱技术分析丙酸睾酮对大肠杆菌recq解旋酶活性和DNA结合活性、AT-Pase活性和构象的影响。结果丙... 详细信息

目的研究体外丙酸睾酮对大肠杆菌recq解旋酶结构和功能的影响及二者的相互作用机制。方法分别运用荧光偏振技术、ATPase试剂盒和紫外吸收光谱技术分析丙酸睾酮对大肠杆菌recq解旋酶活性和DNA结合活性、AT-Pase活性和构象的影响。结果丙酸睾酮能够影响***解旋酶的活性。低浓度促进解旋酶活性,高浓度抑制;抑制recq解旋酶与dsDNA的结合活性,其抑制常数Ki小于7×10-5 nmol.L-1;对与ssDNA结合活性的Ki为7×10-3 nmol.L-1;对ATPase活性抑制作用的时间相关性较弱;影响recq解旋酶的构象变化,但峰位无偏离。结论提示丙酸睾酮与recq解旋酶具有弱相互作用,二者具有两个结合位点。

关键词：丙酸睾酮大肠杆菌 recq解旋酶解旋酶活性 DNA结合活性 ATPase活性构象

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苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶生物学活性的影响

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中国药学杂志 2011年第15期46卷 1146-1150页

作者：段丽霞许厚强陈祥骆衡贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州省动物遗传育种与繁殖人才基地贵阳550025 贵州大学教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室贵阳550025 贵州大学贵州山地农业病虫害重点实验室贵阳550025

目的研究体外苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶生物学活性的影响及作用机制。方法运用荧光偏振技术和ATPase检测技术分析苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶活性、DNA结合活性和ATPase活性的影响。结果苯甲酸雌二醇对recq解旋酶活性、DN... 详细信息

目的研究体外苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶生物学活性的影响及作用机制。方法运用荧光偏振技术和ATPase检测技术分析苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶活性、DNA结合活性和ATPase活性的影响。结果苯甲酸雌二醇对recq解旋酶活性、DNA结合活性及ATPase活性均有弱抑制作用,对recq解旋酶活性抑制常数Ki为5×10-3 nmol.L-1,对dsDNA和ssDNA结合活性的Ki分别为5×10-2和0.5 nmol.L-1。结论在体外苯甲酸雌二醇对大肠杆菌recq解旋酶生物学活性具有弱抑制作用,二者至少有两个作用位点。

关键词：苯甲酸雌二醇 recq解旋酶解旋酶活性 DNA结合活性 ATPase活性

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大肠杆菌recq解旋酶的生物学活性分析

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中国生物化学与分子生物学报 2010年第12期26卷 1143-1150页

作者：骆衡陈祥段丽霞许庆贺许厚强贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室贵州大学动物科学学院贵阳550025 贵州山地农业病虫害重点实验室贵州大学农学学院贵阳550025 教育部绿色农药与农业生物工程重点实验室贵州大学贵阳550025

recq家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类recq家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌recq解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆... 详细信息

recq家族解旋酶是DNA解旋酶中高度保守的一个重要家族,在维持染色体的稳定性中起着重要的作用.人类recq家族解旋酶突变会导致几种与癌症有关的疾病.本研究旨在诱导大肠杆菌recq解旋酶体外表达,并应用生物化学和生物物理学技术研究大肠杆菌recq解旋酶的生物学活性.体外诱导表达获得纯度达90%以上并具有高活性的大肠杆菌重组recq解旋酶,其可溶性好;经生物学活性分析显示具有DNA结合活性、ATP依赖的DNA解链活性、DNA依赖的ATP酶活性.较之双链DNA(dsDNA),大肠杆菌recq解旋酶更容易与单链DNA(ssDNA)结合(P0.05);大肠杆菌recq解旋酶对3种dsDNA的解链速率不同(Precq解旋酶的ATP酶活性与辅助因子ssDNA长度也呈正相关(Precq解旋酶的分子作用机制,并为研究recq解旋酶家族其它成员的结构与功能提供帮助。

关键词：大肠杆菌 recq解旋酶纯化生物学活性

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抗recq解旋酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

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细胞与分子免疫学杂志 2018年第2期34卷 169-174页

作者：张荣红贾铁文廉芳刘杰麟周孟贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵州贵阳550004 贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心国家苗药工程技术研究中心贵州贵阳550004

目的制备抗recq解旋酶单克隆抗体(m Ab),鉴定其生物学特性并开展其对肿瘤细胞中recq解旋酶的检测。方法以纯化鉴定后的重组大肠杆菌recq解旋酶免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗recq解旋酶m Ab。用秋水仙素阻断法对杂交瘤细胞进行染... 详细信息

目的制备抗recq解旋酶单克隆抗体(m Ab),鉴定其生物学特性并开展其对肿瘤细胞中recq解旋酶的检测。方法以纯化鉴定后的重组大肠杆菌recq解旋酶免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗recq解旋酶m Ab。用秋水仙素阻断法对杂交瘤细胞进行染色体核型分析,用间接ELISA检测m Ab的免疫球蛋白(Ig)亚型与效价,用Western blot法和荧光偏振技术鉴定m Ab的生物学特性,使用间接免疫荧光技术检测m Ab与MDA-MB-231乳腺癌细胞中BLM、recq4和recq5的作用。使用免疫组织化学染色法分析该m Ab与K562肿瘤细胞及其干细胞中recq解旋酶的结合。结果获得能稳定分泌抗recq解旋酶m Ab的杂交瘤细胞株6H5,染色体数目在94~104,抗体亚型为Ig G1型,腹水效价为1×10-7。该m Ab能特异性结合大肠杆菌recq解旋酶,抑制其与DNA的结合,并能识别BLM、recq4和recq5解旋酶,还可敏锐检测K562肿瘤细胞与肿瘤干细胞中recq解旋酶的表达。结论成功制备获得效价高、特异性强的抗recq解旋酶m Ab。

关键词： recq解旋酶单克隆抗体制备鉴定应用

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枯草杆菌recq解旋酶精氨酸指与HRDC结构域的功能研究

枯草杆菌RecQ解旋酶精氨酸指与HRDC结构域的功能研究

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作者：吴海丽华东师范大学

学位级别：硕士

recq解旋酶是一种重要的大分子代谢物质,对维持遗传物质的稳定性起到关键作用。研究发现recq解旋酶参与多种代谢过程,如DNA复制、修复、转录重组、核糖体组装、RNA拼接、蛋白翻译,端粒稳定等。虽然目前发现的recq解旋酶种类越来越多,但... 详细信息

recq解旋酶是一种重要的大分子代谢物质,对维持遗传物质的稳定性起到关键作用。研究发现recq解旋酶参与多种代谢过程,如DNA复制、修复、转录重组、核糖体组装、RNA拼接、蛋白翻译,端粒稳定等。虽然目前发现的recq解旋酶种类越来越多,但这类酶在其氨基酸序列上是具有一定的保守性,可选用具有典型功能结构域的模式生物recq酶作为研究对象,对其蛋白结构与功能开展研究工作。本文以枯草杆菌(Bacillus subtilis) recq解旋酶为研究对象,研究其recq的蛋白结构与酶生化活性的相互关系,以揭示recq解旋酶的分子运作机制。本实验室前期工作发现枯草杆菌具有两种天然异构体(本文命名为*** recq L和*** recq S):一个含HRDC区域,另一个则缺失。因此可利用这种特性来进行研究。本实验以Bacillus subtilis168中抽提的基因组DNA和质粒*** recq L-pET15b为模板,PCR扩增分别得到大小为1.5kb和1.8kb的*** recq S和*** recq L的全基因片段,并用重叠PCR定点突变法将两种recq基因片段中的两个精氨酸残基分别进行单突变和双突变,并将野生型和突变型基因克隆入原核表达载体pET24a (+)中,连接产物转化入感受态*** DH5α。挑取单菌落,培养后提取质粒,经菌液PCR和双酶切鉴定,并测序正确后,转化大肠杆菌*** BL21(DE3),用IPTG进行低温诱导表达,结果发现所有目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后,经亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质,检测野生型和突变型蛋白的生化活性。结果表明,Bacillus subtilis recq解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。两个精氨酸残基突变后,recq酶的ATP水解活性明显减弱,表明这两个精氨酸残基参与recq酶与ATP的相互作用。然后采用ATP水解活性抑制剂—原钒酸盐(Vi)来确定枯草杆菌recq解旋酶中的精氨酸指位置,通过实验可确定*** recq S R322和*** recq L R323为精氨酸指结构。为了能够更加直观观察recq酶与DNA的相互作用,本实验使用EMSA和荧光偏振法的方法来进行检测。但由于EMSA的灵敏度不高,则通过灵敏度更高的荧光偏振法来检测枯草杆菌recq解旋酶精氨酸突变体的DNA结合活性。实验证明Bacillus subtilis recq解旋酶对DNA的结合活性具有蛋白浓度依赖性。将精氨酸残基突变后,可能影响了DNA结合到recq酶上的能力,说明R319,R322,R320和R323都参与recq酶与DNA的相互作用,此精氨酸残基能促进recq酶对DNA的结合作用。本文还采用FRET原理来测定DNA的解旋活性,退火活性以及ATP结合活性。将精氨酸残基突变后,Bacillus subtilis recq酶对DNA解旋和ATP结合活性明显降低,说明此精氨酸残基能促进recq酶对DNA解旋和ATP的结合作用。但是对于DNA的退火活性只是在一定程度上受到影响,说明精氨酸残基并不参与酶对DNA的退火配对作用。除此之外,本文还将Bacillus subtilis recq L中的HRDC区域进行截断,并将该基因进行克隆,克隆完成后,进行蛋白表达和纯化。实验结果说明HRDC区域对枯草杆菌recq解旋酶的各种生物活性起到辅助作用。本实验的意义在于为研究recq解旋酶家族其他重要成员的活性功能提供了理论依据。

关键词： recq解旋酶枯草杆菌蛋白表达蛋白纯化精氨酸指 HRDC结构域

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有限稀释法制备recq解旋酶单克隆抗体1C1及鉴定

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贵州医科大学学报 2019年第2期44卷 130-135页

作者：张荣红贾铁文何志旭刘杰麟贵州医科大学组织工程与干细胞中心贵州贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵州贵阳550004

目的:通过有限稀释法制备抗recq单克隆抗体(m Ab),鉴定其生物学特性。方法:以纯化鉴定后的重组大肠杆菌recq解旋酶免疫Balb/c小鼠,融合免疫小鼠的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞,有限稀释法筛选杂交瘤细胞,制备m Ab;使用间接ELISA法鉴定单克... 详细信息

目的:通过有限稀释法制备抗recq单克隆抗体(m Ab),鉴定其生物学特性。方法:以纯化鉴定后的重组大肠杆菌recq解旋酶免疫Balb/c小鼠,融合免疫小鼠的脾细胞及SP2/0骨髓瘤细胞,有限稀释法筛选杂交瘤细胞,制备m Ab;使用间接ELISA法鉴定单克隆抗体亚型、效价,Western-Blot法测定单克隆抗体特异性;将m Ab与recq解旋酶结合后,观察m Ab对recq解旋酶活性的阻断作用。结果:获得1株能稳定分泌抗recq解旋酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株1C1,该杂交瘤细胞染色体数目在94～104; 1C1分泌的单克隆抗体类型为Ig G1型,1C1株所得上清液和腹水中抗体效价分别为1×10-3和1×10-5,该单克隆抗体可特异性结合recq,并可抑制recq解旋酶的结合DNA活性。结论:成功制备1株抗recq m Ab,效价高、特异性强。

关键词： recq解旋酶单克隆抗体制备鉴定有限稀释法

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抗recq解旋酶单克隆抗体6H5在几种肿瘤细胞中的初步应用

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贵州医科大学学报 2018年第10期43卷 1209-1216页

作者：张荣红廉芳周孟贾铁文何志旭刘杰麟贵州医科大学组织工程与干细胞实验中心贵州贵阳550004 贵州医科大学免疫学教研室贵州贵阳550004 贵州医科大学民族药与中药开发应用教育部工程研究中心国家苗药工程技术研究中心贵州贵阳550004

目的:制备抗recq解旋酶单克隆抗体(6H5抗体),鉴定其生物学特性并开展其对肿瘤细胞及肿瘤干细胞中recq解旋酶的检测。方法:在Balb/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞6H5后收集腹水,ELISA法鉴定腹水中6H5抗体,间接免疫荧光技术检测6H5抗体与乳腺癌... 详细信息

目的:制备抗recq解旋酶单克隆抗体(6H5抗体),鉴定其生物学特性并开展其对肿瘤细胞及肿瘤干细胞中recq解旋酶的检测。方法:在Balb/c小鼠腹腔接种杂交瘤细胞6H5后收集腹水,ELISA法鉴定腹水中6H5抗体,间接免疫荧光技术检测6H5抗体与乳腺癌细胞MDA-MB-435、人肾癌细胞GRC-1、人舌癌细胞Tca8113中BLM、recq4和recq5的结合;以6H5抗体作为一抗,免疫组织化学染色法分析Jurkat、MDA-MB-435肿瘤细胞及肿瘤干细胞中recq解旋酶的表达水平。结果:经鉴定,小鼠腹水中6H5抗体阳性,该抗体能识别不同肿瘤细胞株中的BLM、recq4和recq5解旋酶,还可敏锐检测Jurkat、MDA-MB-435肿瘤细胞与肿瘤干细胞中recq解旋酶的表达; recq解旋酶在Jurkat肿瘤干细胞中表达水平明显高于Jurkat肿瘤细胞,而在MDA-MB-435肿瘤干细胞表达水平则低于MDA-MB-435肿瘤细胞,差异有统计学意义(P recq家族解旋酶可以作为多种肿瘤细胞及肿瘤干细胞表面标志物的备选指标。

关键词： recq解旋酶单克隆抗体免疫荧光免疫组织化学染色肿瘤

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人类recq解旋酶在DNA损伤修复通路中的作用

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癌变．畸变．突变 2010年第2期22卷 157-160页

作者：肖芸张爱华贵阳医学院毒理学教研室贵州贵阳550004

人类recq解旋酶是一种多功能DNA解旋酶,在DNA损伤修复及维护基因组稳定性中起着重要作用。本文综合介绍了recq解旋酶的结构与生物学特性及其在多条DNA损伤修复通路中的作用,以及recq解旋酶在疾病治疗中的应用前景和人类recq解旋酶缺陷... 详细信息

人类recq解旋酶是一种多功能DNA解旋酶,在DNA损伤修复及维护基因组稳定性中起着重要作用。本文综合介绍了recq解旋酶的结构与生物学特性及其在多条DNA损伤修复通路中的作用,以及recq解旋酶在疾病治疗中的应用前景和人类recq解旋酶缺陷与肿瘤、遗传性疾病、环境相关疾病的关系。

关键词： recq解旋酶 DNA损伤修复疾病

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以recq家族解旋酶为靶点的抗癌活性分子研究进展

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中国药物化学杂志 2023年第10期33卷 770-782页

作者：高海琳曾家颖袁昊吴璧含周盈宸陈硕斌中山大学药学院广东广州510006

recq解旋酶家族成员是一类具有ATP依赖性的DNA解旋酶,可以解散包括双链、霍利迪结等多种核酸高级结构。研究表明,recq解旋酶家族成员活性的异常与癌症的发生发展存在重要关联。抑制家族成员如BLM、WRN的活性可选择性杀伤特定类型的癌细... 详细信息

recq解旋酶家族成员是一类具有ATP依赖性的DNA解旋酶,可以解散包括双链、霍利迪结等多种核酸高级结构。研究表明,recq解旋酶家族成员活性的异常与癌症的发生发展存在重要关联。抑制家族成员如BLM、WRN的活性可选择性杀伤特定类型的癌细胞,提示该家族蛋白可能是潜在抗癌新靶标。本综述将介绍蛋白成员结构与功能的特点,结合分子模拟技术比较蛋白的不同结构域中的潜在结合位点,总结以recq解旋酶为靶点的小分子抑制剂的发现与相关药物化学生物学研究现状,探讨以recq解旋酶为靶点的抗癌先导化合物发现策略与应用前景。

关键词： recq解旋酶癌症解旋酶抑制剂合成致死药物化学生物学

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