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RT-LAMP与real time-pcr在手足口检测中的应用与比较

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世界最新医学信息文摘 2016年第18期16卷 176-177页

作者：高杰承德市疾病预防控制中心

目的比较不同实验室检测方法在手足口病标本检测中的应用价值。方法对2014年采集的678份疑似咽拭子或肛拭子标本,采用real time-pcr法和RT-LAMP法检测手足口病重要病原柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型。结果 678份标本中,real time-pcr... 详细信息

目的比较不同实验室检测方法在手足口病标本检测中的应用价值。方法对2014年采集的678份疑似咽拭子或肛拭子标本,采用real time-pcr法和RT-LAMP法检测手足口病重要病原柯萨奇病毒A16型和肠道病毒71型。结果 678份标本中,real time-pcr法检出251份阳性,RT-LAMP法检出250份阳性,两种方法的检测结果无统计学差异(P>0.05)。RT-LAMP检测方法具有良好的灵敏性和特异性。结论 RT-LAMP检测方法灵敏特异,简单快速,比real-time pcr更适合应用于基层疾控医疗机构。

关键词：手足口病 real time-pcr RT-LAMP 方法学比较

番茄水通道蛋白基因SlAQP的克隆与序列分析

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中国农业科学 2012年第2期45卷 302-310页

作者：李仁吴新新李蔚杨荣超赵永钦温常龙赵冰郭仰东中国农业大学农学与生物技术学院

【目的】通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SlAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料。【方法】采用RACE技... 详细信息

【目的】通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SlAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料。【方法】采用RACE技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将SlAQP基因与GFP融合的瞬时表达载体(SlAQP::GFP)转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用real time-pcr分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制。【结果】SlAQP基因(GenBank登录号:HQ433337)cDNA全长为1 107 bp,编码区含852 bp,共编码283个氨基酸。生物信息学软件分析表明,SlAQP基因含有6个跨膜区,2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致,且该基因氨基酸序列与其它物种PIP类质膜型水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性。11个物种间的聚类分析表明,SlAQP基因编码的蛋白与马铃薯质膜型水通道蛋白遗传距离最近。细胞定位结果确认SlAQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用。Southern杂交结果显示,SlAQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝。real time-pcr分析结果证实,干旱胁迫下该基因表达量总体呈下降趋势。【结论】对番茄水通道蛋白SlAQP基因在干旱胁迫后的表达模式分析,预示该基因表达受逆境条件的影响,为今后进一步探讨其在干旱胁迫中发挥的作用提供了重要信息。

关键词：番茄水通道蛋白序列分析细胞定位 real time-pcr

辣椒水通道蛋白基因CaAQP的克隆与序列分析

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中国农业科学 2010年第20期43卷 4323-4329页

作者：陈儒钢朱文超巩振辉李大伟尹延旭逯明辉西北农林科技大学园艺学院

【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因... 详细信息

【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用realtime-pcr分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该基因大小为1032bp,含5′非编码区为69bp,3′非编码区为210bp,CDS长753bp,编码250个氨基酸,蛋白分子量为25.7kD。应用生物信息学软件对CaAQP分析表明,CaAQP含有6个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其它物种TIP类液泡膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。聚类分析表明,CaAQP与番茄液泡膜水通道蛋白遗传距离最近,与禾本科的玉米和大麦遗传距离相对较远。realtime-pcr分析结果证实,该基因在低温胁迫下呈现下调表达的趋势。【结论】利用cDNA-AFLP并结合RACE技术首次在耐寒辣椒品种中克隆了水通道蛋白基因CaAQP,该基因属于MIP蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,表达模式分析表明,该基因在低温胁迫过程中具有重要的调控作用,该研究结果为进一步探讨辣椒逆境胁迫过程中基因表达调控机制提供了重要信息。

关键词：辣椒水通道蛋白基因克隆序列分析 real time-pcr

多年生黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP的克隆及功能分析

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中国农业科学 2013年第12期46卷 2412-2420页

作者：周春蕾李仁吴新新杨荣超张海军张娜赵冰郭仰东中国农业大学农学与生物技术学院

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草(品种"顶峰")中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构... 详细信息

【目的】研究黑麦草在逆境胁迫下水分代谢的基因调控,克隆黑麦草质膜型水通道蛋白基因的全长cDNA序列,并对其表达模式进行研究。【方法】利用RACE技术从黑麦草(品种"顶峰")中获得LpAQP全长cDNA序列;运用生物信息学软件分析其编码蛋白;构建LpAQP与GFP融合的瞬时表达载体,采用基因枪法转入洋葱表皮细胞,观察其细胞定位;通过real time-pcr分析LpAQP的表达模式,并用Southern杂交分析其拷贝数。【结果】克隆获得LpAQP的cDNA序列,GenBank登录号为JX569791,其开放阅读框(ORF)为867 bp,编码288个氨基酸,蛋白质分子量为30.7 kD。该基因含有2个NPA单元,6个跨膜区,LpAQP含有与MIP家族完全一致的蛋白质保守区,其氨基酸序列与其它禾本科PIP类质膜型水通道蛋白同源性较高。物种间聚类分析表明LpAQP与大麦、小麦质膜型水通道蛋白同源性较高。LpAQP可能定位于细胞质膜上。通过Southern杂交分析,发现LpAQP在黑麦草基因组中以单拷贝存在。real time-pcr分析表明LpAQP在黑麦草茎部表达高于叶和根,持续干旱胁迫会导致LpAQP表达量先上调后下降。【结论】克隆获得黑麦草质膜型水通道蛋白基因LpAQP,其以单拷贝形式存在,在黑麦草根、茎、叶中均有表达,尤其是茎中表达最高。其表达受干旱胁迫影响。

关键词：黑麦草水通道蛋白细胞定位 real time-pcr

玉米BPC家族基因的生物信息学与表达规律分析

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河北农业大学学报 2020年第5期43卷 27-33页

作者：周帆米淑玲张晓燕藏金萍张康邢继红董金皋河北省植物生理与分子病理学重点实验室/河北农业大学真菌毒素与植物分子病理学实验室河北保定071000 河北省沧州市运河区农业局河北沧州061000

BASIC PENTACYSTEINE(BPC)基因家族是植物特异性的转录因子家族,在基因转录调控过程中发挥重要的作用。为探究玉米BPC家族基因的功能及其调控机制,本研究利用生物信息学技术,对玉米BPC家族基因进行系统进化分析、基因结构分析、保守结... 详细信息

BASIC PENTACYSTEINE(BPC)基因家族是植物特异性的转录因子家族,在基因转录调控过程中发挥重要的作用。为探究玉米BPC家族基因的功能及其调控机制,本研究利用生物信息学技术,对玉米BPC家族基因进行系统进化分析、基因结构分析、保守结构域分析、组织表达特性分析以及在玉米抵抗非生物胁迫过程中的表达规律分析。结果发现,玉米的4个BPC家族基因均含有保守的GAGA结合结构域,具有明显的组织表达特性,在热、冷、盐、UV和干旱胁迫下呈现不同的表达规律。利用real-time pcr技术,检测玉米BPC家族基因在不同激素处理后表达水平,发现4个BPC家族基因在水杨酸、茉莉酸、乙烯利处理后的表达水平均发生明显的变化。结果表明BPC家族基因在玉米生长发育以及抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用,为阐明玉米BPC家族基因的功能及其调控机制奠定了基础。

关键词：玉米 BPC 生物信息学分析 real time-pcr

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Transcriptional Distribution in Various Organs and Transcriptional Response to Abiotic Stress for Trehalose Metabolism Genes in Arabidopsis thaliana

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Transcriptional Distribution in Various Organs and Transcrip...

AQP1、AQP3在人不同退变级别椎间盘髓核细胞中表达的相关研究

2010 First International Conference on Cellular,Molecular Biology, Biophysics and Bioengineering(CMBB 2010)

作者： Yanzhai Song Shuang Liu Mei Wen Wei Huang Xiangli Song and Bei Guo College of biotechnology Beijing University of Agriculture Beijing China

Trehalose（α-D-glucopyranosyl-1,1-α-D-glucopyranoside） is a non-reducing disaccharide. It is currently thought that just trace level of trehalose was detected in plants,and that trehalose metabolic pathway was significantly related to stress tolerance. In this study,we report that expression levels of three genes with regard to trehalose metabolic pathway were measured in Arabidopsis thaliana,including AtTPS1,AtTPPA and AtTRE1. As a result,transcriptional levels of these genes are the highest in floral organ,and the expression of AtTRE1 is much more than AtTPS1 and AtTPPA. Additionally,we present transcriptional response analyses in drought and heat stresses,which have shown the changes of these genes expression from tolerance in early stress to senescence in later stress.

关键词： trehalose trehalase trehalose-6-phosphate synthase trehalose-6-phosphate phosphatase real time-pcr

来源： cnki会议评论

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AQP1、AQP3在人不同退变级别椎间盘髓核细胞中表达的相关研究

作者：王贵宾山西医科大学

学位级别：硕士

目的：椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration, IVDD）是引起腰腿痛的一个重要原因,但目前为止,椎间盘退变的生理、病理机制仍未明确。髓核组织的退变是椎间盘退变的中心环节,本研究拟通过免疫组化方法和real time-pcr技术对正... 详细信息

目的：椎间盘退变（Intervertebral disc degeneration, IVDD）是引起腰腿痛的一个重要原因,但目前为止,椎间盘退变的生理、病理机制仍未明确。髓核组织的退变是椎间盘退变的中心环节,本研究拟通过免疫组化方法和real time-pcr技术对正常组和退变组的髓核组织中水通道蛋白1（Aquaporin1, AQP1）和水通道蛋白3（Aquaporin3, AQP3）表达水平的比较研究,探讨水通道蛋白1和水通道蛋白3在椎间盘髓核组织中的作用,了解水通道蛋白在椎间盘髓核的生理及病理意义,探讨-种新的椎间盘退变的病理生理机制,进而为椎间盘退变的防治提供一种新的思路和方向。方法：根据Pfirrmann分级方法将椎间盘髓核组织标本分为5个等级,1-5级分别对应A、B、C、D、E五个组别。将标本进行固定、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,然后运用HE染色技术观察髓核组织退变的病理表现。随后运用免疫组织化学和real time-pcr技术观察AQP1及AQP3在椎间盘髓核的表达水平,分别测量其免疫组化阳性细胞平均光密度（MOD）和mRNA表达含量。对得出的数据运用17.0统计软件进行单因素方差分析。结果：***染色观察：正常组：髓核组织结构疏松,基质成分完整,髓核细胞多,胶原纤维走行清楚,细胞核结构完整。退变组：髓核组织皱缩,基质成分减少,胶原纤维增生粗大,走行紊乱,髓核细胞少,细胞核结构不完整。 2.免疫组化分析：退变组AQP1及AQP3的阳性细胞表达较正常组明显减弱,其MOD值随椎间盘退变程度加重呈进行性下降。对各组间的MOD值行单因素方差分析,AQP1:A组与C、D、E组比较,B组与D、E组比较,C组与E组比较,D组与E组比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;其余各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。AQP3的MOD值在各个组间两两比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。对AQP1、AQP3的MOD值和Pfirrmann分级、年龄之间进行Pearson积矩线性相关分析：AQP1与Pfirrmann分级之间呈显著反相关（]=-0.862, P＜0.01）;AQP3与Pfirrmann分级之间呈显著反相关（1=-0.944, P＜0.01）;AQP1与年龄之间呈显著反相关（r=-0.794,P＜0.01）,AQP3与年龄之间呈显著反相关（r=-0.881,P＜0.01）。 3. real time-pcr分析：退变组髓核组织的Ⅱ型胶原mRNA表达较正常组明显减少,AQP1及AQP3的mRNA表达随椎间盘退变程度加重呈进行性下降。对各组间AQP1及AQP3的mRNA表达行单因素方差分析,AQP1：A组与C、D、E组比较,B组与D、E组,C组与E组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;其余各组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。AQP3:A组与D、E组比较,B组与D、E组,C组与E组比较差异有统计学意义（P＜0.05）;其余各组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：人正常髓核组织与退变髓核组织中的AQP1、AQP3在蛋白和基因水平上的表达存在显著差异;与正常髓核相比,退变髓核的AQP1、AQP3的表达明显降低;并且随着椎间盘髓核退变级别的加重AQP1、AQP3的表达含量呈进行性降低。

关键词：椎间盘退变髓核 AQP1 AQP3 real time-pcr

天山雪莲Trxh和GLP基因的克隆与功能分析

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天山雪莲Trxh和GLP基因的克隆与功能分析

作者：刘超石河子大学

学位级别：硕士

天山雪莲（Saussurea involucrata *** Kir）是具有代表性的高寒多年生植物。它具有很强的抗氧化和清除自由基的能力以适应极端环境。我们从天山雪莲cDNA文库中分别克隆到一种新的硫氧还蛋白和类萌发素蛋白基因，命名为SikTrxh和SikGLP... 详细信息

天山雪莲（Saussurea involucrata *** Kir）是具有代表性的高寒多年生植物。它具有很强的抗氧化和清除自由基的能力以适应极端环境。我们从天山雪莲cDNA文库中分别克隆到一种新的硫氧还蛋白和类萌发素蛋白基因，命名为SikTrxh和SikGLP。分别对这两类基因进行生物信息学分析和real time-pcr分析后构建植物过表达载体，通过农杆菌介导叶盘转化烟草，对转基因烟草进行低温、干旱等逆境胁迫，通过生理指标的测定和形态的观察，分析转基因烟草的抗逆性。结果如下：对天山雪莲硫氧还蛋白基因SikTrxh的生物信息学分析表明，该基因cDNA全长565bp，包含一个长为354bp的开放阅读框（ORF），编码117个氨基酸，分子量为12.97kDa，理论等电点是5.34，属于硫氧还蛋白家族，并且是不含有信号肽定位于细胞质的亲水性蛋白，多序列比对发现保守性较高。real time-pcr检测表明，SikTrxh基因受低温、干旱、MV和NaCl胁迫诱导表达，在植物抗逆过程中发挥作用。通过构建植物过表达载体转化烟草，利用RT-pcr方法鉴定阳性植株，组培快繁获得转基因株系，进行低温、干旱、高温和NaCl胁迫，并对其生理指标和部分抗氧化酶活性进行测定。结果显示，逆境胁迫下MDA含量和REL均升高，但野生型上升幅度明显高于转基因型;转基因型PSⅡ光抑制程度低于野生型;抗氧化物酶类SOD、APX和CAT酶活性均高于野生型。这说明转SikTrxh烟草能降低ROS的毒害作用，保护质膜系统，增强了植物对逆境的抵抗能力。对天山雪莲类萌发素蛋白基因SikGLP的生物信息学分析表明，该基因包含1个633bp的完整开放阅读框，编码210个氨基酸。SikGLP分子量为21.6kDa，理论等电点是6.81，属于cupin家族蛋白，并且是具有信号肽的疏水性蛋白。氨基酸多序列比对发现GLP序列保守性较高，具有的GLP的典型特征。16个物种间的系统发育树可以看出与葡萄GLP进化关系最近。real time-pcr检测表明，SikGLP基因受低温、甲基紫精和PEG诱导表达，可能在胁迫初期对提高植物防御起作用。通过构建植物过表达载体转化烟草，利用RT-pcr方法鉴定阳性植株，组培快繁获得转基因株系，进行低温、干旱和NaCl胁迫实验，结果表明，转SikGLP基因烟草在逆境胁迫下未表现出较强的抗性，推测是作为受体参与植物的生理反应。

关键词：天山雪莲 real time-pcr SikTrxh SikGLP 抗逆性

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感染根管控制过程中细菌学分析研究

感染根管控制过程中细菌学分析研究

作者：刘晓璐第四军医大学

学位级别：硕士

细菌等微生物侵入根管系统中的牙髓组织导致牙髓病或根尖周病，这种被微生物感染的根管系统常被称为感染根管。人们对微生物在感染根管内的发展认识经历了一个漫长的过程。研究感染根管内的细菌对揭示牙髓炎及根尖周炎的发病机制起着关... 详细信息

细菌等微生物侵入根管系统中的牙髓组织导致牙髓病或根尖周病，这种被微生物感染的根管系统常被称为感染根管。人们对微生物在感染根管内的发展认识经历了一个漫长的过程。研究感染根管内的细菌对揭示牙髓炎及根尖周炎的发病机制起着关键作用。口腔内常驻菌多达500种，但只有那些能够穿透牙体硬组织或牙周组织屏障进入根管系统并抵制宿主免疫系统的细菌才会引起根管系统中牙髓的感染。从1894年Miller首次证实感染根管内存在细菌，随着科学技术突飞猛进的发展，厌氧菌已被公认是感染根管内的优势菌，近年来分子生物学技术的提高推动了微生物学研究的发展，一些新的菌种，尤其是未获培养的微生物相继被检出。本实验旨在从微生物的总数变化、6种优势菌的检出率及其与临床症状和体症相关性和定量分析进行研究，为深入探讨治疗过程中感染根管的菌群控制奠定理论基础，同时也为更好地评价我院根管治疗术的临床疗效提供实验依据。实验一三种感染根管内细菌种类和数量的变化本研究针对临床上收集的57例感染根管，采用传统的细菌培养方法对病原菌进行初步分析检测。结果显示：在西安地区感染根管的患者菌群分布特点为：产黑色素菌属中牙髓卟啉单胞菌与牙龈卟啉单胞菌检出率是最高的，其次是肠道菌属的粪肠球菌、链球菌属的咽峡炎链球菌、乳杆菌中的嗜酸乳杆菌与发酵乳杆菌、消化链球菌属中的微小链球菌和普氏消化链球菌、梭杆菌属中的具核梭杆菌与坏死梭杆菌、放线菌属中的粘氏放线菌、韦荣菌属中的小韦荣氏球菌。其中产黑色素菌属、放线菌属与梭杆菌属与三种分类有统计学意义。实验二感染根管中六种厌氧菌与症状和体征的相关性研究应用16S rRNA pcr技术测定感染根管内6种细菌的检出率，分析根管内细菌种类与临床症状及体征的关系。采集48例感染根管样本，按照临床症状或体征分为自发痛、叩痛、窦道3组，提取样本细菌基因组DNA，用pcr扩增细菌16S rRNA基因片段的方法检测细菌种类，计算检出率。结果显示：检测病例48例，其中35例检测到待检细菌，检出率达72.9%。检出率最高的是牙髓卟啉单胞菌(35.4％)，其次是牙龈卟啉菌(31.2％)和粪肠球菌(29.1％)，咽峡炎链球菌为(18.7%)，仅2例能检出古菌,轻链球菌未检出。统计学分析显示，牙龈卟啉单胞菌与自发痛、粪肠球菌与窦道分别存在相关性（p﹤0.05）。结论：根管感染是多重细菌感染;其中这5种细菌是感染根管的优势菌;感染根管内的牙龈卟啉菌和粪肠球菌能检出与临床相关的症状或体征。实验三三种细菌在感染根管中的定量分析本实验讨论感染根管中牙龈卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌、粪肠球菌所占比例与总细菌量的比较,探讨牙龈卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌、粪肠球菌与感染根管发生发展是否有关系。方法：常规pcr方法检测牙龈卟啉单胞菌为阳性的48例慢性根尖周炎患者,实时荧光定量pcr方法定量检测样本中牙龈卟啉单胞菌、总菌量。结果：本研究设计的引物和探针具有良好的特异性及敏感性。存在显著正相关关系( P pcr对牙体牙髓病学研究具有广泛的应用前景。

关键词：感染根管厌氧菌 pcr 16S rRNA real time-pcr