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rav2基因调控植物高光效的作用机理研究

RAV2基因调控植物高光效的作用机理研究

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作者：苏比努尔·玉苏甫中国农业科学院

学位级别：硕士

光合作用是地球初级生产力的基础。而工业革命以来的碳排放导致了全球持续变暖,传统的作物育种方法可能已经接近“产量上限”,迫切要求进一步提高作物的产量及抗逆性。提高光合效率可能会对增加植物生产力具有变革性影响,尽管目前植物... 详细信息

光合作用是地球初级生产力的基础。而工业革命以来的碳排放导致了全球持续变暖,传统的作物育种方法可能已经接近“产量上限”,迫切要求进一步提高作物的产量及抗逆性。提高光合效率可能会对增加植物生产力具有变革性影响,尽管目前植物高光效研究取得了一定的进展,但仍有诸多挑战。本课题前期研究中通过对C-C中间型植物Moricandia suffruticosa(Ms)与C植物油菜(Brassica napus)的系统比较分析,筛选出候选基因Ms rav2。前人一些研究发现rav2基因参与了植物的生长发育,但对于rav2基因在光合作用中的功能仍然未知。因此,本课题通过对Ms rav2过表达拟南芥和rav2突变体最大光化学效率、叶绿素荧光动力学、PSI互补量子产量等光合参数、光合复合物及亚基、产量相关性状及油菜Ms rav2过表达植株净光合速率、叶绿素荧光动力学及光合蛋白的分析,以期初步解析rav2基因调控植物高光效的作用机理。本文主要研究结果如下:(1)在正常条件下,野生型与Ms rav2过表达拟南芥的最大光化学效率没有显著差异,而在高光或高温胁迫处理后,与野生型相比,Ms rav2过表达及rav2突变体的Fv/Fm均显著提高;Ms rav2过表达株系NPQ升高,表明Ms rav2通过增加光化学热耗散保护PSII免受光损伤;ΦPSII和ETR均高于野生型,这说明受到高光、高温逆境胁迫后,Ms rav2过表达株系与rav2突变体能保持稳定的光化学量子产量与电子传递。拟南芥产量相关性状与光合参数结果一致,过表达株系能够在逆境胁迫中保持稳定的光合效率。正常条件下,拟南芥野生型与过表达株系光合复合物及亚基并没有明显差异,而在高光或高温胁迫处理后,相比于野生型,过表达株系中PSII核心蛋白D1、D2、CP43、CP47亚基和LHCII三聚体含量均升高。这些结果表明rav2基因通过调控拟南芥PSII的活性提高植物的抗逆性。(2)在正常条件下,Ms rav2过表达油菜株系净光合速率显著高于对照,其净光合速率相比对照可提高38%-54%。胁迫条件下rav2过表达油菜的叶绿素荧光参数与拟南芥的结果一致。在高光或高温处理后,相比对照,Ms rav2过表达油菜Fv/Fm显著提高,NPQ、ΦPS(II)和ETR同样显著升高,这表明Ms rav2可提高油菜PSII电子传递速率并增加热耗散量,缓解了对PSII功能的破坏,从而增强了油菜的抗逆性。通过对油菜光合复合物的分析,发现Ms rav2过表达使得油菜PSII-LHCII超级复合物增加,尤其是在高光或高温处理后,LHCII蛋白含量相比对照显著增加。进一步的光合蛋白分析表明,正常条件下油菜Ms rav2过表达株系中PSII核心蛋白亚基相比对照有一定增加;而在高光或高温处理后,Ms rav2过表达株系中PSII核心蛋白亚基、LHCII捕光天线蛋白含量相比对照显著增加。这些实验结果表明rav2主要调控PSII的功能。综上,本项研究通过对rav2过表达拟南芥和油菜光合相关参数及光合蛋白复合物等方面的分析,初步解析了rav2调控光合的重要作用,这为植物高光效基因功能的研究和通过改良光合提高作物产量与抗逆性提供了理论基础。

关键词： rav2 拟南芥油菜逆境胁迫高光效

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酿酒酵母ravE复合物的纯化

酿酒酵母RAVE复合物的纯化

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作者： Chung Thanh Nguyen 江南大学

学位级别：硕士

在真核细胞内，液泡质子转运ATP酶（V-ATP酶）存在于内膜系统，如液泡，内涵体，溶酶体，高尔基体，披网格蛋白小泡和一些细胞的细胞膜。其酸化功能在许多正常细胞和病变细胞中都起着核心作用。因此对V-ATP酶的结构和调控机制的研究显... 详细信息

在真核细胞内，液泡质子转运ATP酶（V-ATP酶）存在于内膜系统，如液泡，内涵体，溶酶体，高尔基体，披网格蛋白小泡和一些细胞的细胞膜。其酸化功能在许多正常细胞和病变细胞中都起着核心作用。因此对V-ATP酶的结构和调控机制的研究显得格外重要。关于酿酒酵母V-ATP酶的许多研究成果已有发表，但目前V-ATP酶的调控机制仍然尚不明确。 ravE（Regulator of the H+-ATPase of the Vacuolar and Endosomal membranes）能够调节V-ATP酶的可逆分解和组装。ravE复合物由三个亚基所组成，他们分别为rav1p、rav2p、Skp1p。目前，关于ravE复合物的研究并不多见。研究ravE复合物的空间结构，对进一步了解其如何调节V-ATPases的组装和重新组装具有非常重要的作用。 FLAG标签是含8个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为N-Asp Tyr Lys Asp Asp AspAspLys-C。它不会影响蛋白的结构并且能够用于高纯度纯化蛋白。在本文中，将FLAG标签融合于rav1p和rav2p，并用亲和层析技术纯化ravE复合物。转化后获得3株重组菌株，分别为：在rav1p的N端融合FLAG标签的酿酒酵母BY4742FLAG-rav1;在rav1p的C端融合FLAG标签的酿酒酵母BY4742rav1-FLAG;在rav2p的C端融合FLAG标签的酿酒酵母BY4742rav2-FLAG。将重组酿酒酵母菌株接种于8L的YEPD培养基，在30°C,200rpm条件下培养。培养细胞（OD600约为3）,离心收菌，菌体重悬于含1mM PMSF的TBSE缓冲液（50mMTris/Cl,150mM NaCl,1mM EDTA, pH7.4），用高压破碎仪在25,000p.s.i下破碎。细胞破碎液在4°C下用20,000xg离心20min。离心后取上清液，上样于1mL的anti-FLAG M2亲和层析柱。用TBSE缓冲液洗去杂蛋白，然后用含100μg/ml FLAG多肽TBSE缓冲液洗脱目的蛋白。结果显示，从酿酒酵母BY4742rav2-FLAG中纯化ravE复合物的效果好于酿酒酵母BY4742rav1-FLAG和酿酒酵母BY4742FLAG-rav1两株重组菌。质谱分析成功鉴定出洗脱液中的目的蛋白。研究结果显示ravE复合物从酿酒酵母BY4742rav2-FLAG中纯化成功。

关键词：酿酒酵母 ravE 复合物 rav1 rav2 Skp1 V-ATPase

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