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RKIP在免疫性肝纤维化发生机制中的调控作用

RKIP在免疫性肝纤维化发生机制中的调控作用

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作者：梁春宏广西医科大学

学位级别：硕士

目的肝纤维化是由多种病因导致慢性肝病共有的病理改变,特征性地表现为肝内细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的过度合成与沉积。有多项研究证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝纤维化形成过程中的关键细胞成分,是肝内... 详细信息

目的肝纤维化是由多种病因导致慢性肝病共有的病理改变,特征性地表现为肝内细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的过度合成与沉积。有多项研究证实,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是肝纤维化形成过程中的关键细胞成分,是肝内ECM的主要细胞来源。目前认为抑制HSCs活化与增殖是阻止并逆转肝纤维化的主要途径之一。近年来研究发现,raf-1/mek/erk1,2信号通路参与了 HSCs活化与增殖的调控过程,与肝纤维化的发生发展关系密切,可从多方面影响肝纤维化的形成。而raf激酶抑制蛋白(RKIP)是该信号通路的抑制因子,是否意味着RKIP在肝纤维化中具有重要的调控作用?引起了我们极大兴趣和深入研究。本实验采用免疫性肝纤维化动物模型和体外细胞模型,研究raf激酶抑制蛋白(RKIP)在肝纤维化不同时期肝组织中的分布及含量变化,以及信号通路蛋白erk的活化情况,探讨肝纤维化进程中raf-1/mek/erk1,2信号通路的激活与RKIP的表达和磷酸化水平的相关性;同时,利用IL-iβ激活HSCs细胞,检测细胞活化情况,以及RKIP、erk1/2、p-erk1/2和胶原的表达水平,了解RKIP对HSCs增殖、凋亡的影响。本研究将初步阐明RKIP在肝纤维化发生机制中的调控作用。方法第一部分动物实验SD雄性大鼠88只,模型组(60只)用无菌猪血清腹腔注射0.5mL/只,每周2次,共18周,复制大鼠肝纤维化模型;正常对照组(28只)腹腔注射生理盐水0.5mL/只,每周两次。各组分别于第8wk、11wk、14wk、18wk随机选取正常对照组7只,模型组15只,眼球取血后立即处死,留取左叶肝组织于-80℃保存,再切取部分肝脏左叶以4%多聚甲醛固定,以备后用。采用全自动生化分析仪检测血清ALT、AST水平,ELISA试剂盒法检测血清Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)含量;ELISA试剂盒法检测肝组织Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)含量;HE染色、Masson三色染色检测肝纤维化发展情况;免疫组织化学检测肝组织RKIP、p-RKIP、p-erk1/2、erk1/2表达情况;RT-PCR法检测肝组织 RKIP mRNA、COL-Ⅰ mRNA、COL-Ⅲ mRNA、erk1 mRNA、erk2 mRNA的表达量;Western blot方法检测肝组织RKIP、p-RKIP、p-erk1/2、erk1/2、raf、p-raf、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、mek、p-mek 和 α-SMA的蛋白表达水平。第二部分细胞实验采用密度梯度离心法提取分离大鼠原代肝星状细胞(HSCs)并采用免疫细胞化学染色法检测细胞活化情况。细胞被IL-1β和Locostatin(RKIP阻断剂)处理后,采用MTT法检测HSCs的增殖;RT-PCR法检测RKIP mRNA、erk1 mRNA、COL-Ⅰ mRNA、COL-Ⅲ mRNA 的表达量,Western blot方法检测 RKIP、erk1/2、p-erk1/2、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ和 α-SMA 的蛋白表达水平。结果1.成功复制免疫性肝纤维化动物模型血清学实验结果表明,与正常组比较,模型组中ALT、AST值随造模时间的延长出现先升高后下降的趋势;血清HA、LN、COL-Ⅰ、PCⅢ的含量均高于正常组大鼠;HE染色和Masson染色结果表明,模型组肝细胞可见慢性炎细胞浸润,肝索排列紊乱,汇管区和中央静脉结缔组织变厚,肝组织胶原纤维明显增多;RT-PCR检测结果显示,COL-Ⅰ mRNA、COL-ⅢmRNA的表达量高于正常组;Western blot检测结果显示,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ的表达量随造模时间的延长而升高(pmek/erk1,2信号通路在肝纤维化中的表达情况免疫组织化学法检测结果显示,正常组大鼠肝组织中erk及p-erk表达很少,而模型组大鼠肝组织中erk及p-erk的表达量较高,且随着造模时间的延长,erk及p-erk的表达量呈递增趋势;RT-PCR检测结果表明,erk1 mRNA和erk2 mRNA的表达随造模时间延长呈上升趋势;Western blot检测发现,erk在正常肝组织中表达量较少,模型组中erk表达量增多;p-erk在正常组大鼠肝组织中表达量较少,随造模时间的延长,模型组中p-erk的表达量先升高后出现下降的趋势;随造模时间的延长,raf的表达量呈下降趋势,而p-raf呈上升趋势;mek在正常组的表达量较高,随造模时间的延长出现下降的趋势,p-mek

关键词： RKIP raf-1/mek/erk1 2信号通路免疫性肝纤维化猪血清肝星状细胞(HSCs)

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