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Journal of Genetics and Genomics 2013年第10期40卷 533-542页

作者： Peng-Juan Liang Wen-Yuan Han Qi-Hong Huang Yan-Ze Li Jin-Feng Ni Qun-Xin She Yu-Long Shen State Key Laboratory of Microbial Technology Shandong University Archaeal Centre Department of BiologyUniversity of CopenhagenOle Maal es Vej 5Copenhagen BiocenterDK-2200 CopenhagenDenmark

RecA family recombinases play essential roles in maintaining genome integrity. A group of RecA-like proteins named RadC are present in all archaea, but their in vivo functions remain unclear. In this study, we performed phylogenetic and genetic analysis of two RadC proteins from Sulfolobus islandicus. RadC is closer to the KaiC lineage of cyanobacteria and proteobacteria than to the lineage of the recombinases （RecA, rada, and Rad51） and the recombinase paralogs （e.g., RadB, Rad55, and Rad51B）. Using the recently- established S. islandicus genetic system, we constructed deletion and over-expression strains of radC1 and radC2. Deletion of radC1 rendered the cells more sensitive to DNA damaging agents, methyl methanesulfonate （MMS）, hydroxyurea （HU）, and ultraviolet （UV） radiation, than the wild type, and a AradCIAradC2 double deletion strain was more sensitive to cisplatin and MMS than the AradC1 single deletion mutant. In addition, ectopic expression of His-tagged RadC 1 revealed that RadC I was co-purified with a putative structure-specific nuclease and ATPase, which is highly conserved in archaea. Our results indicate that both RadCI and RadC2 are involved in DNA repair. RadCl may play a general or primary role in DNA repair, while RadC2 plays a role in DNA repair in response to specific DNA damages.

关键词： RecA-like protein rada RadC Sulfolobus DNA repair

超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii rada蛋白的克隆表达及其辐射可诱导性

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微生物学报 2008年第3期48卷 317-322页

作者：盛多红朱珊珊李铭峰焦建东倪金凤申玉龙山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100

RecA/Rad51/rada家族蛋白是细胞内重要的重组修复蛋白,在功能上非常保守。研究发现在细菌、真核生物、甲烷古菌和嗜盐古菌细胞内RecA/Rad51/rada均可以受紫外线辐射诱导转录。而对极端嗜热古菌中的rada辐射可诱导性仍存在争议。通过体... 详细信息

RecA/Rad51/rada家族蛋白是细胞内重要的重组修复蛋白,在功能上非常保守。研究发现在细菌、真核生物、甲烷古菌和嗜盐古菌细胞内RecA/Rad51/rada均可以受紫外线辐射诱导转录。而对极端嗜热古菌中的rada辐射可诱导性仍存在争议。通过体外表达极端嗜热古菌Sulfolobus tokodaii的rada蛋白,制备抗体,利用免疫学方法并结合RT-PCR分析,对嗜热古菌S.tokodaii中rada的辐射诱导进行了研究。经过100J/m2和200J/m2UV辐照处理,rada基因的转录分别上调了2倍和3倍,同时rada蛋白的表达分别上升了1.5倍和1倍。实验结果表明S.tokodaii中rada可以被紫外线辐射诱导表达,证实了极端嗜热古菌S.tokodaii细胞中存在DNA损伤诱导反应的观点。

关键词：嗜热古菌 rada 辐射可诱导性 DNA修复

Co-expression with rada and the characterization of stRad55B, a rada paralog from the hyperthermophilic crenarchaea Sulfolobus tokodaii

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Science China(Life Sciences) 2008年第1期51卷 60-65页

作者： SHENG DuoHong, LI MingFeng, JIAO JianDong, NI JinFeng & SHEN YuLong State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100, China State Key Laboratory of Microbial Technology Shandong University Jinan 250100 China

ST0838 (designed stRad55B) is one of the four rada paralogs (or Rad55 homologues) in the genome of the hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus tokodaii. The gene is induced by UV irradiation, sug-gesting that it is involved in DNA recombinational repair in this organism. However, this protein could not be expressed normally in vitro. In this study, thermostable and soluble stRad55B was obtained by co-expression with S. tokodaii rada (strada) in E. coli, and the enzymatic properties were examined. It was found that stRad55B bound ssDNA preferentially and had a very weak ATPase activity that was not stimulated by DNA. The recombinant protein inhibited the strand exchange activity promoted by strada, indicating that stRad55B might be an inhibitor to the homologous recombination in this ar-chaeon. The results will be helpful for further functional and interaction analysis of rada paralogs and for the understanding of the mechanism of recombinational repair in archaea.

关键词： Archaea recombinational repair rada Rad55 co-expression

耐辐射奇球菌rada蛋白参与DNA损伤修复过程

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科学通报 2006年第20期51卷 2381-2386页

作者：周庆张新觉徐虹徐步进华跃进浙江大学原子核农业科学研究所杭州310029 浙江大学原子核农业科学研究所

rada是一个高度保守的蛋白.在古细菌中,rada蛋白具有RecA类似的功能并在同源重组过程中起关键作用.在大肠杆菌中,rada蛋白也参与了同源重组和DNA损伤修复过程,但远没有在古细菌中的功能那么重要.PSI-BLAST结果表明,与古细菌以及真核细胞... 详细信息

rada是一个高度保守的蛋白.在古细菌中,rada蛋白具有RecA类似的功能并在同源重组过程中起关键作用.在大肠杆菌中,rada蛋白也参与了同源重组和DNA损伤修复过程,但远没有在古细菌中的功能那么重要.PSI-BLAST结果表明,与古细菌以及真核细胞中rada蛋白相比,耐辐射奇球菌rada蛋白和细菌中的rada的相似性更高.研究发现,耐辐射奇球菌rada基因的突变增加了耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线照射的敏感性,但对过氧化氢氧化胁迫的抗性没有影响.耐辐射奇球菌和大肠杆菌rada基因均能完全补偿突变体对γ射线和紫外线辐照的抗性.进一步的结构域功能分析表明,与rada突变体的抗性相比,锌指结构域的缺失导致耐辐射奇球菌对γ射线和紫外线辐照更加敏感;仅仅缺失Lon蛋白酶结构域的耐辐射奇球菌表现为比rada突变体略微更抗γ射线和紫外线辐照处理.这些实验结果表明,耐辐射奇球菌rada蛋白的确参与了DNA损伤修复过程,而且不同的结构域具有不同的功能.

关键词：耐辐射奇球菌 rada DNA损伤修复结构域补偿功能

DNA重组酶同系物stRadC2在超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii细胞内的功能分析

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中国科学：生命科学 2012年第3期42卷 226-233页

作者：王蕾盛多红韩文元黄彬朱姗姗倪金风李佳申玉龙山东大学生命科学学院微生物技术国家重点实验室济南250100 山东中医药大学药学院济南250100

真核生物和广古菌的Rad51/rada同系物在重组和修复过程中起重要作用,比如Rad51同系物Rad51C的突变体与人类乳腺癌和卵巢癌的发生直接相关.超嗜热广古菌硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)编码4个rada同系物,它们序列上与rada相近,但在细胞... 详细信息

真核生物和广古菌的Rad51/rada同系物在重组和修复过程中起重要作用,比如Rad51同系物Rad51C的突变体与人类乳腺癌和卵巢癌的发生直接相关.超嗜热广古菌硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)编码4个rada同系物,它们序列上与rada相近,但在细胞内的功能还不清楚.对这些蛋白的研究有助于更好地了解人类Rad51同系物的功能.本文对其中一个rada同系物stRadC2蛋白的功能进行了研究.Pull-down分析发现,stRadC2能够直接和DNA重组酶rada和Holliday junction内切酶Hjc相互作用.进一步的酶学分析证明,stRadC2能够抑制rada的链交换活性并促进Hjc对Holliday junction DNA的切割活性.RT-PCR分析发现,虽然stRadC2的表达不能被紫外线(UV)辐射诱导,但是它可在DNA修复后期迅速恢复表达,上述结果表明,stRadC2蛋白可能作为一种抗重组酶,在DNA重组修复的后期发挥作用.

关键词：古菌硫化叶菌重组 rada stRadC Hjc

泉古菌Sulfolobus tokodaii rada同系物stRad55B与rada的共表达及其对rada重组活性的抑制

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中国科学（C辑） 2008年第2期38卷 160-165页

作者：盛多红李铭峰焦建东倪金凤申玉龙山东大学微生物技术国家重点实验室济南250100

ST0838(定义为stRad55B)是超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)编码的4个rada的同系物(或Rad55同源蛋白)之一.研究发现,它能够被紫外线(UV)辐射损伤诱导,可能参与了细胞内的DNA损伤修复过程,然而利用常规方法,该蛋白不能体外可溶性地表达.... 详细信息

ST0838(定义为stRad55B)是超嗜热古菌(Sulfolobus tokodaii)编码的4个rada的同系物(或Rad55同源蛋白)之一.研究发现,它能够被紫外线(UV)辐射损伤诱导,可能参与了细胞内的DNA损伤修复过程,然而利用常规方法,该蛋白不能体外可溶性地表达.通过和rada共表达,得到了具有热稳定性的可溶stRad55B蛋白,并对其活性进行了初步检测.stRad55B优先结合单链DNA,并且具有不依赖DNA的ATP酶活性.另外,DNA链交换实验发现stRad55B能够明显抑制rada催化的链重组活性,表现出一个重组修复系统抑制蛋白的特征.实验结果为进一步研究古菌中rada同系蛋白的功能以及相互作用机制,揭示古菌DNA同源重组修复机理提供了依据.

关键词：古菌重组修复 rada Rad55 共表达

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冰岛硫化叶菌中rada基因的遗传学分析

冰岛硫化叶菌中radA基因的遗传学分析

作者：田斌华中农业大学

学位级别：硕士

同源重组修复是一类重要的针对双链DNA分子断裂的修复方式。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物中参与DNA同源重组修复的重要蛋白。泉古菌Sulfolobus solfataricus中的rada蛋白是最早被分离纯化并进行生化性质研究的与RecA蛋白和R... 详细信息

同源重组修复是一类重要的针对双链DNA分子断裂的修复方式。RecA蛋白和Rad51蛋白分别是细菌和真核生物中参与DNA同源重组修复的重要蛋白。泉古菌Sulfolobus solfataricus中的rada蛋白是最早被分离纯化并进行生化性质研究的与RecA蛋白和Rad51蛋白同源的类似蛋白。在嗜盐古菌Haloferax volcanii中将rada基因敲除后,得到的突变体表现出生长速率下降,并且对DNA诱变剂敏感性增加。但是,在嗜热古菌中,由于遗传操作体系的缺乏,至今对于rada基因的研究还仅限于一些体外的生理生化性质方面,而对其在体内的遗传学分析则从未报道过。本实验以pyrEF和lacS基因双缺失突变的Sulfolobus islandicus E233s作为研究对象。在构建敲除载体的过程中,对位于rada基因两端的DNA分子片段进行PCR扩增得到两段同源序列臂,分别命名为L-arm和R-arm。接着利用PCR技术扩增出一个用araS启动子替换了rada基因自身启动子的DNA分子片段,命名为T-Gene。最终得到的敲除载体是在pUC19载体的多克隆位点处依次插入了R-arm、L-arm、pyrEF+lacS marker和T-Gene。将线性化的敲除载体电转化S.islandicus E233s后,利用不含尿嘧啶的选择性培养基筛选线性化载体发生双交换整合到染色体上的转化子。得到的双交换转化子经过划线纯化后,直接倒PSCVYU+5-FOA的双层平板进行反筛选rada基因的缺失突变体。但是经PCR验证,平板上长出的单菌落全部是pyrEF基因自发突变产生的。为此,本课题又进行了反筛选富集实验,期望能够筛选得到rada基因功能互补型的缺失突变株。反筛选富集实验中得到的几株经X-gal染色显白色的菌落经验证亦不是rada基因的缺失突变株,而可能是pyrEF和lacS基因的双自发突变体。这些实验结果说明rada基因对于S.islandicus的生长是必需的。此外,通过将rada双交换转化子放在3种不同碳源的培养基中进行培养并测定生长曲线,我们发现rada基因的表达差异对细胞的生长速率有着十分明显的影响。本课题首次说明了rada基因对于嗜热古菌Sulfolobus islandicus的生长是一个必需基因。但是在其他嗜热古菌中,rada基因是否也是一类必需基因呢?如果是,则说明同源重组在嗜热古菌中的生物学功能有着十分重要的作用;如果不是,则说明在嗜热古菌中rada基因可能还有着其他方面的重要功能。

关键词：冰岛硫化叶菌 rada 同源重组基因敲除

超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii rada同源蛋白的生化性质鉴定

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超嗜热古菌Sulfolobus tokodaii RadA同源蛋白的生化性质鉴定

作者：朱珊珊山东大学

学位级别：硕士

同源重组是生物中普遍存在的DNA修复途径,它对于修复DNA断裂、维持基因组稳定性、重启复制叉以及真核生物的减数分裂都具有重要作用。目前对于古菌同源重组的研究还仅处于初级阶段,然而却发现了相似于真核生物同源重组机制中的蛋白:重... 详细信息

同源重组是生物中普遍存在的DNA修复途径,它对于修复DNA断裂、维持基因组稳定性、重启复制叉以及真核生物的减数分裂都具有重要作用。目前对于古菌同源重组的研究还仅处于初级阶段,然而却发现了相似于真核生物同源重组机制中的蛋白:重组早期处理断裂双链的蛋白Mrell和Rad50;在广古菌中存在的单链结合蛋白RPA;古菌中的重组酶(recombinase)rada,它与真核生物中的Rad51具有约40%的同源性,与RecA仅有约20%的同源性;相似于真核生物中存在Rad51的同源蛋白,在广古菌中也存在rada的同源蛋白。 RecA/Rad51/rada是三域生物中同源重组的关键蛋白,在同源重组中促进链交换形成Holliday junction结构。在细菌及真核生物中许多蛋白参与介导RecA/Rad51形成核蛋白丝或帮助其进行链交换,如细菌中的RecBCD、RecFOR复合体,真核生物中的Rad52、Rad54、Rad55和Rad57等。在真核生物中存在Rad51的同源蛋白包括酵母中的Rad55/Rad57复合体、高等真核生物中的Rad51B-Rad51C-Rad51D-XRCC2和Rad51C-XRCC3复合体。遗传分析表明它们参与了同源重组,其中Rad55/Rad57已被鉴定稳定Rad51核蛋白丝的结构。在广古菌中也存在rada的同源蛋白RadB。然而,目前还没有对泉古菌中rada同源蛋白的报道。我们通过序列分析,在嗜热泉古菌Sulfolobus tokodaii Str.7基因组中找到四个rada的同源蛋白,系统发育分析表明它们更加相似于真核生物中的Rad55,因而我们把它们命名为stRad55A(ST0579),stRad55B(ST0838),stRad55C(ST1830)和stRad55D(ST2522)。运用RT-PCR分析了S.tokodaii rada、rad55A、rad55B、rad55C及rad55D基因转录受紫外线照射的诱导性,发现rada、rad55A和rad55B的基因转录是受紫外线诱导的,表明这些蛋白可能参与DNA修复。在E.coli中表达了这些蛋白及S.tokodaii单链结合蛋白SSB,其中rada、stRad55A、stRad55C和SSB在E.coli表达菌中能够以可溶的形式表达,stRad55B和stRad55D以包涵体的形式表达。分子筛层析结果表明rada、stRad55A和stRad55C在溶液中分别以寡聚体的形式存在,SSB以单体的形式存在。进一步对stRad55A、stRad55B和stRad55C进行了生化性质鉴定,发现(1)stRad55A具有很多相似于Rad52的性质:相对于双链DNA(dsDNA),对单链DNA(ssDNA)具有更大的亲和性;具有ssDNA依赖的ATPase活性;可以解除SSB对rada链交换活性的影响;可以介导rada结合至SSB覆盖的ssDNA链;与rada和SSB都有相互作用。然而,也有与Rad52不同的性质:在没有SSB的链交换反应体系中抑制rada的活性;没有检测到它对DNA的退火活性。(2)通过stRad55B与rada的共表达,得到了stRad55B蛋白的可溶性形式并纯化了stRad55B蛋白,说明stRad55B与rada具有相互作用,可以形成复合体;相对于dsDNA,stRad55B对ssDNA具有更大的亲和性;具有不依赖于DNA的较弱的ATPase活性;在没有SSB的链交换反应体系中抑制rada的活性。目前所得到的生化性质数据显示stRad55B的性质更加相似于RadB。(3)stRad55C与stRad55A相同,更易结合ssDNA,具有ssDNA依赖的ATPase活性;stRad55C与S.tokodaii中的rada和Hjc具有相互作用;在没有SSB的链交换反应体系中抑制rada的活性;促进Hjc切割Holliday junction的活性。我们对S.tokodaii的研究是首次对泉古菌中rada同源蛋白进行鉴定。目前所得到的数据并不能完全阐释蛋白在细胞内的具体作用,但一些生化性质鉴定以及蛋白相互作用检测结果证实这些蛋白参与了DNA修复。蛋白在细胞内的具体作用机制需要更多的生化性质鉴定及遗传分析。

关键词：超嗜热泉古菌同源重组 rada同源蛋白 rada

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用于分子自组装的短肽rada的合成研究

用于分子自组装的短肽RADA的合成研究

作者：王俊四川大学

学位级别：硕士

本课题是国家自然科学基金项目“分子自组装rada16-RGD/CPP纳米仿生基质骨修复材料的研究”(50472091,2005～2007年)中的一部分。可用于骨修复、骨组织工程及药物缓释的可降解生物材料rada16-RGD/CPP是细胞表面可识别的特异结合基质材料... 详细信息

本课题是国家自然科学基金项目“分子自组装rada16-RGD/CPP纳米仿生基质骨修复材料的研究”(50472091,2005～2007年)中的一部分。可用于骨修复、骨组织工程及药物缓释的可降解生物材料rada16-RGD/CPP是细胞表面可识别的特异结合基质材料。本文研究用液相法合成可用于分子自组装的(rada)十六肽的最小单元――rada活性短肽。为进一步研究多肽的分子自组装提供了物质基础。本研究成功地对氨基酸的氨基、羧基以及精氨酸的胍基进行了保护,得到了BocArg(NO)OH,Z-Ala,BocAsp(OBzl)OH,AlaOBzl·TosOH中间体。这些中间体的结构经TLC、熔点、红外分析确认。在合成Z-Ala时,运用正交实验设计优选了最佳的实验条件:当丙氨酸用量为4.685g时,氯代甲酸苄酯(Z-Cl)用量为4ml、反应时间2h、pH值9、反应温度25℃,产率最高。接肽反应采用从末端氨基酸开始的反向合成路线。以N-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)为复合缩合剂,三乙胺调节反应体系pH,THF为溶剂。保护基团叔丁氧羰基(Boc)用HCl/乙酸乙酯脱去,苄氧羰基(Z)用HBr/HOAc脱去,最后在Pd/C催化下氢解去掉其它的保护基团。反应后得到的粗品用硅胶柱色谱纯化,粗品肽用乙醇和水重结晶精制。所得目标化合物的结构经TLC、红外分析、核磁共振氢谱确认。实验表明,在液相法逐步接肽过程中,用HCl/乙酸乙酯脱叔丁氧羰基(Boc),HBr/HOAc脱苄氧羰基(Z),在N-羟基苯并三唑(HOBt)、N,N-二环己基碳二酰亚胺(DCC)及三乙胺存在下接肽和生成复合物,是一种可供选择的方法。

关键词： rada 多肽合成分子自组装氨基酸保护

定向天线WSN改进算法rada的设计与实现

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网络安全技术与应用 2017年第1期 60-61,64页

作者：郑少雄广东生态工程职业学院广东510642

传统的无线传感器网络LEACH算法由于在簇头形成时没有考虑节点的能量和位置,存在着网络能耗过大的缺点,本文利用定向天线能够对射频信号进行定向扩散的特点,对独立节点进行分簇归类,设计改进路由算法,并在NS2网络模拟软件平台上进行仿真... 详细信息

传统的无线传感器网络LEACH算法由于在簇头形成时没有考虑节点的能量和位置,存在着网络能耗过大的缺点,本文利用定向天线能够对射频信号进行定向扩散的特点,对独立节点进行分簇归类,设计改进路由算法,并在NS2网络模拟软件平台上进行仿真,对改进的算法与LEACH算法进行对比分析,结果表明rada算法使得网络的生命周期更加延长,网络稳定性更好。

关键词：无线传感器网络 rada 路由算法