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rxr motif在倍半萜合酶催化产物特异性中的作用

RXR motif在倍半萜合酶催化产物特异性中的作用

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作者：郝庆刚河北大学

学位级别：硕士

萜类化合物普遍存在于植物、微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还可以帮助在药物、香精等应用... 详细信息

萜类化合物普遍存在于植物、微生物的次级代谢产物中。随着越来越多的萜类化合物的发现,对萜类合酶的研究也更加深入,这不仅可以帮助我们从理论上认识萜类化合物的合成机制,理解萜类合酶结构和功能的关系,还可以帮助在药物、香精等应用方面的研究更进一步。萜类合酶不同的催化机理是揭示萜类化合物数量和结构多样性的关键,对其保守基序DDXXD、NSE/DTE、rxr的研究更是其中的重点。本文选取了倍半萜合酶保守基序rxr作为研究切入口,探讨在两种不同的倍半萜合酶催化机制中该保守基序对催化产物特异性的影响,并做了如下工作:1.为探讨RXR基序对倍半萜环化酶产物特异性的影响,我们选择对青蒿紫穗槐二烯合酶(Artemisia annua Amorpha-4,11-diene synthase,ADS)R262、R264进行单突变,并将R262K和T296A/V/I进行联合突变,发现:R262辅助farnesyl diphosphate(FPP)离子化释放焦磷酸基团需要侧链氨基的存在,但是环化反应中间产物nerolidyl diphosphate((R,E)-NPP)的离子化不需要R262的协助就可以实现。推测T296A/V/I可以和R262K通过其他氨基孙或底物碳骨架发生相互作用,而且这种相互作用的结果跟底物构象有关,双突变不能作用于(E,E)-FPP,但是可以催化(R,E)-NPP、(S,E)-NPP分别生成对应的amorpha-4,7(11)-diene和farnesene,以及二者共有的nerolidol、α-bisabolol,作用于(Z,E)-FPP时,双突变可以抑制R262K环化反应中阳离子中间体对水的捕获。R264K对产物没有影响。2.为探讨RXR基序对反式倍半萜环化酶产物特异性的影响,我们选择反式环化酶烟草马兜铃烯合酶(Tobacco 5-epi-aristolochene synthase,TEAS)R264、R266进行单突变,发现:虽然TEAS催化(Z,E)-FPP经历顺式异构,但是R264K并不能明显增加产物中萜醇的生成;底物伯碳位焦磷酸基团的释放需要266位侧链含氨基的残基协助,但是叔碳位焦磷酸的基团则不需要该位点发挥作用。R266K突变体使酶丧失活性。3.倍半萜合酶RXR基序中的第一个R可以辅助FPP离子化,并引入水分子猝灭环化过程形成的阳离子中间体生成萜醇,第二个R作用机制尚不明确。而且,rxr对底物构象具有特异性。

关键词：紫穗槐二烯合酶马兜铃烯合酶 RXR基序定点突变

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青蒿紫穗槐二烯合酶C-末端截短和两个关键区域突变对其功能的影响

青蒿紫穗槐二烯合酶C-末端截短和两个关键区域突变对其功能的影响

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作者：高瑞平河北大学

学位级别：硕士

萜类是植物天然代谢产物的重要组成部分，迄今为止，人们已经从自然界各种生物中分离鉴定了55,000多种萜类化合物，其数量和结构的多样性都是由萜类环化酶的活动引起的。随着大量有价值的萜类不断被发现，对萜合酶的研究也变得更加有意... 详细信息

萜类是植物天然代谢产物的重要组成部分，迄今为止，人们已经从自然界各种生物中分离鉴定了55,000多种萜类化合物，其数量和结构的多样性都是由萜类环化酶的活动引起的。随着大量有价值的萜类不断被发现，对萜合酶的研究也变得更加有意义，不仅在理论方面可以帮助我们更好地理解萜合酶的催化机理，了解其结构与功能的关系，而且在应用方面对开发新的药物也具有重要意义。萜类化合物的研究中最令人感兴趣的问题是生物如何特异性产生出数量如此众多的萜类化合物。而萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决此问题的关键。本文围绕倍半萜合酶催化机理做了以下工作： 1．为探讨C-末端对酶活性的影响，对青蒿紫穗槐二烯合酶（Amorpha-4,11-diene synthaseof Artemisia annua ADS）C末端进行了系列截短（6、7、8、9、10、14、29个氨基酸），发现：C-末端截短6个氨基酸（C6），活性有所下降，C7几乎丧失活性，C8-C10能保持微弱活性，而C14和C29活性完全丧失。这些结果表明，虽然C-末端没有参与活性中心的形成，但是其结构对维持酶的活性起重要作用。 2．为研究G螺旋纽结对ADS活性的影响，对螺旋处的G400、G401、A402、L405进行单突变和联合突变，除A402外，其余单点突变均改变了酶的产物特异性。G401A突变造成γ-humulene和amorpha-4,7(11)-diene比例增多，推测G401跟最终产物的去质子化有关。而G400A只造成γ-humulene比例增多，G401A和G400A双突变amorpha-4,7(11)-diene和γ-humulene比例与G401相比进一步增加，显示共显性作用。T399L造成amorpha-4,7(11)-diene比例增加，T399L和G401A双突变中γ-humlene消失，amorpha-4,7(11)-diene比例增加，说明T399L抑制γ-humulene生成，表现出上位效应。L405A突变后侧链变短造成口袋变大，使第二次环化无法完成，但并不影响异构化和第一次环化反应。而且水分子容易进入活性中心，形成倍半萜醇。 3．对ADS RXR基序及相关的D300位点进行了点突变，发现保守基序中R262K单点突变后其酶促反应主产物为(R,E)-Nerolidol，而R262L突变使酶失去活性，R264K突变则对产物比例无影响，显示保守基序中第一个精氨酸在活性中心疏水环境的维持中非常关键。D300突变结果显示此氨基酸对酶的活性维持非常必要，结合R262突变结果，推测R262和D300间的非键相互作用对酶活性的维持起重要作用。

关键词：青蒿紫穗槐二烯合酶 C-末端截短 G螺旋 RXR基序定点突变

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