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GM-CSF-Ag85B-rv3872-CFP10-ESAT6重组卡介苗的构建与鉴定

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GM-CSF-Ag85B-Rv3872-CFP10-ESAT6重组卡介苗的构建与鉴定

作者：曹德君华中农业大学

学位级别：硕士

结核病是由结核杆菌复合群引起的一种人畜共患病,具有较高的感染率和死亡数。该病不仅严重影响人类的身体健康,还对畜牧业造成惨重的经济损失。据统计,每年全球约有三分之一的人口潜伏感染结核,约有940万新发结核病例,170万人死于结核... 详细信息

结核病是由结核杆菌复合群引起的一种人畜共患病,具有较高的感染率和死亡数。该病不仅严重影响人类的身体健康,还对畜牧业造成惨重的经济损失。据统计,每年全球约有三分之一的人口潜伏感染结核,约有940万新发结核病例,170万人死于结核感染。同时,每年有5千万牛感染结核,导致30亿的损失。在人结核防治上,主要采取新生婴儿BCG(Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin)免疫和结核病人的抗生素治疗。BCG免疫只对儿童有保护效果,且不同地区免疫保护效果差异很大。结核病治疗病程长,需6个月以上;药物副作用大;且由于多耐药药和泛耐药菌株的出现,治疗效果越来越差。因此,急需开发新型高效疫苗,增加对儿童的保护力,同时对成年有效。由于结核病的人兽共患特征,动物结核的防控措施是“检疫-扑杀”,不做免疫。但“检疫-扑杀”政策具有很多缺陷,难以实质性实施。首先,检疫-扑杀的成本过高,发展中国家难以承受;其次,动物结核病主要由牛分枝杆菌引起,该菌宿主范围极广,不同宿主间的传播导致“检疫-扑杀”政策效果差;同时,野生动物难以进行检疫和扑杀。因此,动物结核病的防控也急需要有效疫苗。目前医学上结核疫苗的开发主要基于两方面：1)改良传统BCG,向BCG中引入保护性抗原,增强免疫力;2)致弱毒力型结核分枝杆菌。由于BCG来自于牛分枝杆菌,而人结核是主要由结核分枝杆菌引起,因此,人们希望用相当种类的细菌开发新型疫苗,以获得更佳的免疫保护。由于牛结核等动物结核主要是由牛分枝杆菌引起,因此研究改良BCG既可以为人结核防控提供新型疫苗,也可以为动物结核病的防控提供新的手段。与毒力型牛分枝杆菌比较,BCG基因组缺失了多个RD区基因,其中有部分基因具有良好的免疫原性,能诱导免疫保护。向BCG中引入这些基因,可提高BCG的免疫保护作用。能诱导免疫保护作用的结核杆菌蛋白基因主要有：TB10.4, Ag85A, Ag85B, CFP-10, ESAT-6, HSP65和Mtb39A等。其中部分已被引入到BCG中,并证明能增强BCG的免疫保护作用。有一些细胞因子作为分子佐剂也被应用到重组BCG的研发中,常用的有GM-CSF, IL-2, IL-12, IFN-y等。在本研究中将结核分枝杆菌中具有高免疫原性的保护性抗原Ag85B、rv3872、 CFP10, ESAT6以及细胞因子GM-CSF联合引入BCG,旨在构建一个理想的人和动物结核病候选疫苗菌株。主要研究内容和结果如下：1.相关基因克隆与鉴定以MtbH37rv基因组为模板,PCR扩增Ag85B (A)、rv3872 (R)、CFP10 (C)以及ESAT6 (E)基因,将其串联成ARCE,克隆至pET32载体,经酶切和测序鉴定正确,然后转化大肠杆菌BL21感受态中,进行诱导表达,证明串联基因能够表达;用实验室制备的兔抗RCE(rv3872-CFP10-ESAT6)多抗,Western blot分析重组蛋白,证实这些基因均能表达出具有免疫原性的重组蛋白。生工生物工程(上海)有限公司合成GM-CSF(G)基因,将其与Ag85B、rv3872、CFP10以及ESAT6基因串联,构成GARCE,克隆至pET32载体,经酶切和测序鉴定正确,然后转化大肠杆菌进行诱导表达,证明串联基因能够表达;用实验室制备的兔抗RCE(rv3872-CFP10-ESAT6)多抗,Western blot分析重组蛋白,证实这些基因均能表达出具有免疫原性的重组蛋白。2.相关质粒的构建和鉴定将GM-CSF(简称G)、Ag85B (A)、rv3872 (R)、CFP10 (C)以及ESAT6(E)进行串联,各基因之间以连接序列进行连接,并分别克隆至大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261和整合载体pTIC6a中,分别构建含GM-CSF和不含GM-CSF的重组质粒,分别命名为：pMV261-GARCE, pMV261-ARCE;pTIC6a-GARCE, pTIC6a-ARCE。酶切鉴定、PCR扩增和测序等方法证实构建正确。3.重组BCG的构建和鉴定通过电转化方法将四种重组质粒分别转化至BCG,用Western blot方法分析引入基因在重组BCG中的表达及其反应原性,结果显示外源基因在BCG中成功表达。进一步检测重组BCG在体外培养的生物学特性,发现重组BCG与亲本BCG具有相似的生长曲线、菌落形态、染色形态。4.重组BCG的小鼠免疫试验一共120只小鼠(Balb/C),分成六组,每组20只,包括四个重组BCG组、1个PBS空白对照、BCG亲本株组。免疫剂量为106CFU,采取皮下接种的方式。每三周每组处死3只老鼠,观察重组BCG在体内诱导的免疫反应,从体液免疫和细胞免疫两方面评价重组BCG的免疫性。对小鼠血清中的抗体水平进

关键词：重组BCG 结核疫苗 GM-CSF Ag85B rv3872 CFP10 ESAT-6

rv3872/CFP-10/ESAT-6融合蛋白的人工合成及表达

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吉林畜牧兽医 2013年第6期34卷 33-35页

作者：王楠付延军赵子丰王春华王晓锋吉林省动物疫病预防控制中心吉林长春130062 吉林市农科院吉林吉林市132000 吉林正业生物制品股份有限公司吉林吉林市132000

根据牛分枝杆菌AF2122/97基因组中rv3872、CFP-1O和ESAT-6全长基因序列,以柔性linke(rG4S)3,将三基因序列进行串联,形成表达基因盒(rv3872-CFP1O-ESAT6,RCE),人工合成并克隆于PUC57转移载体上(PUC57-RCE)。经EcoRI和HindIII双酶切PUC57-RCE,回收纯化RCE片段,与经过相同双酶切的pET-28a载体,于16℃水浴连接过夜,连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞,重组质粒经培养鉴定,测序结果证实插入的REC片段序列编码和方向与预期一致。在优化的诱导条件下表达蛋白,分段收集样本,并各取少量进行SDS-PAGE,经Western-blot分析显示,融合蛋白RCE具有较好的免疫原性,与阳性牛血清在35kDa位置处有明显的反应带。

关键词：奶牛结核病融合蛋白 rv3872 CFP-10 ESAT-6 人工合成表达

结核分枝杆菌rv3872与rv3873基因的克隆及重组真核表达载体的构建

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安徽农学通报 2017年第8期23卷 12-15页

作者：李双双李木楠关松磊张文慧张林波吉林农业大学生命科学学院吉林长春130118

目的:克隆结核分枝杆菌rv3872与rv3873基因,并构建rv3872与rv3873基因的重组真核表达载体,为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法:利用PCR技术克隆rv3872与rv3873基因序列,将其连接至pMD-18T载体,鉴定成功后将rv3872与rv3873序列插... 详细信息

目的:克隆结核分枝杆菌rv3872与rv3873基因,并构建rv3872与rv3873基因的重组真核表达载体,为研究这2个基因的功能奠定实验基础。方法:利用PCR技术克隆rv3872与rv3873基因序列,将其连接至pMD-18T载体,鉴定成功后将rv3872与rv3873序列插入真核表达载体pEGFP-C1,构建重组pEGFP-C1-rv3872和pEGFP-C1-rv3873真核表达载体,并进行质粒PCR、双酶切以及测序验证。结果:经测序比对后,rv3872与rv3873序列与Gene Bank中公布的基因序列一致,重组载体构建成功。结论:成功构建重组pEG-FP-C1-rv3872和pEGFP-C1-rv3873真核表达载体。

关键词：结核分枝杆菌 rv3872 rv3873 真核载体

融合蛋白rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

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中国奶牛 2009年第10期 7-11页

作者：刘冬光廖娟红于清龙陈颖钰陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室武汉430070 华中农业大学动物医学院武汉430070

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,... 详细信息

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6蛋白,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG0.4mmol/L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94%(17/18)。因此,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

关键词：牛结核 rv3872 CFP-10 ESAT-6 诊断

融合蛋白rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

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融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

融合蛋白rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

中国奶业协会2009年会

作者：刘冬光廖娟红于清龙陈颖钰陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6.以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法.克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因... 详细信息

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6.以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法.克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG 0.4mmol L-1诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中.Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA.检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份.检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94(17/18)。因此,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下.敏感性获得了显著提高.这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

关键词：牛结核 rv3872 CFP-10 ESAT-6 诊断

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融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用

不同佐剂组合对结核分枝杆菌四种蛋白的免疫原性影响

中国奶业协会第24次繁殖学术年会暨国家奶牛/肉牛产业技术体系第一届全国牛病防治学术研讨会

作者：刘冬光廖娟红于清龙陈颖钰陈焕春郭爱珍华中农业大学农业微生物学国家重点实验室华中农业大学动物医学院

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因... 详细信息

本研究通过融合表达rv3872、CFP-10和ESAT-6,以改良牛结核病特异性鉴别诊断抗原CFP-10-ESAT-6,提高牛结核抗体鉴别诊断法的灵敏度。利用PCR方法,克隆牛分枝杆菌RD1区上述三个基因,通过酶切连接方法,将三个基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接。融合基因在大肠杆菌内经IPTG 0.4mmol L诱导3h,目的蛋白经SDS-PAGE证实表达在上清中,Western-blot分析证实表达蛋白具有免疫原性。以所表达的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA,检测了44份牛分枝杆菌感染背景清楚的临床奶牛血清。26份阳性血清中,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA检出阳性样本18份,检测灵敏度为69%,而CFP-10-ESAT-6融合蛋白ELISA只检出阳性样本4份。18份阴性血清中,两种ELISA均检出17份阴性血清,特异性都为94(17/18)。因此,rv3872-CFP-10-ESAT-6融合蛋白在对牛结核抗体检测特异性没有降低的情况下,敏感性获得了显著提高,这对牛结核病的早期鉴别诊断方法的建立具有重要意义。

关键词：牛结核 rv3872 CFP-10,ESAT-6 诊断

来源： cnki会议评论

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基因组学与应用生物学 2021年第11期40卷 3500-3507页

作者：时晓慧马国荣张舒林李荣秀上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海200240

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)因其免疫记忆减弱,对于成人结核病的预防效果较差,通过使用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原构建结核亚单位疫苗可进一步增强免疫保护作用。本研究选用了MTB不同结构组分中的四... 详细信息

卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)因其免疫记忆减弱,对于成人结核病的预防效果较差,通过使用结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)抗原构建结核亚单位疫苗可进一步增强免疫保护作用。本研究选用了MTB不同结构组分中的四种蛋白rv0577、rv2831、rv3048c、rv3872,并分别在原核表达体系中实现蛋白的可溶性表达,经亲和色谱纯化可得到高纯度的目的蛋白。以不同的佐剂组合与纯化的结核蛋白混合后免疫BALB/c小鼠,收集血清后用酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测体液免疫效果。结果表明,以胞嘧啶—鸟嘌呤寡脱氧核苷酸(cytosine phosphoguanine oligonucleotide,CpG)和铝(aluminiumhydroxide,Al)作为佐剂,能显著提高免疫原性较弱的rv0577、rv3048c和rv3872的IgG效价,对免疫原性较强的rv3872的抗体滴度无显著影响,并且佐剂的使用对小鼠体重无改变。这表明CpG和Al的联合应用可提高弱免疫原性结核蛋白的免疫应答且无明显毒副作用,可作为结核亚单位疫苗的一种有效佐剂配方。

关键词：佐剂 rv0577 rv2831 rv3048c rv3872 免疫原性

牛分枝杆菌新型融合抗原的制备及在牛结核抗体检测中的应用

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牛分枝杆菌新型融合抗原的制备及在牛结核抗体检测中的应用

作者：刘冬光华中农业大学

学位级别：硕士

牛结核病(Bovine Tuberculosis, bTB)是一种严重危害养牛业的、慢性消耗性人兽共患病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)感染所致。同时,牛分枝杆菌是人结核病的重要致病因子之一,野生动物是牛结核分枝杆菌重要的储存宿... 详细信息

牛结核病(Bovine Tuberculosis, bTB)是一种严重危害养牛业的、慢性消耗性人兽共患病,主要由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis, M. bovis)感染所致。同时,牛分枝杆菌是人结核病的重要致病因子之一,野生动物是牛结核分枝杆菌重要的储存宿主。目前国内外控制家畜和野生动物结核病普遍采用“检疫-扑杀”的措施,因此,准确及时的诊断结核病对有效控制该病、保障动物和人类健康显得极为重要。目前法定的牛结核检疫方法是结核菌素皮内变态反应(Tuberculin skin test, TST),由于TST具有劳动强度大、操作复杂、费时、与卡介苗和非结核分枝杆菌等具有交叉反应等缺陷,牛结核病检测需要探索更加灵敏快速的检测方法。发达国家的实践也证实,控制或根除牛结核病非常有必要依靠实验室检测方法。国际兽疫局(OIE)也推荐使用皮试以外的方法,如IFN-y体外释放法、抗体检测法等。这些方法的关键之一就是选择灵敏特异的刺激抗原或诊断抗原。牛分枝杆菌感染机体过程中分泌多种抗原,使用单个抗原检测其抗体水平或刺激IFN-y体外释放时灵敏度较低。研究证明,“鸡尾酒”诊断方法能提高诊断的敏感性,但使用多种蛋白抗原存在生产费时费力,使用时配比不均,难于进行标准化生产等问题。鉴于以上原因,本研究对三种RDl区缺失基因rv3872、CFP10和ESAT6进行了融合表达rv3872-CFP10-ESAT6 (RCE)三蛋白,该蛋白可以区分卡介苗与毒力型结核分枝杆菌与牛分枝杆菌,并将rv3872基因插入70-83-CE蛋白基因的前面,融合表达了rv3872-MPB70-MPB83-CFP10-ESAT6 (R5)五蛋白,旨在为牛结核病临床诊断提供更加敏感、特异的诊断抗原。同时,建立了RCE间接ELISA方法,制备了RCE-胶体金试纸条并进行了初步应用。本研究的主要内容如下：1.两种融合蛋白表达载体的构建、抗原的表达纯化克隆了牛结核分枝杆菌RD1区基因rv3872,构建了原核表达载体pET-28a-RCE和pET-28a-rv3872-70-83-CE,诱导表达融合蛋白,并用亲和层析法进行纯化,得到了纯度较高的RCE蛋白,但R5蛋白在纯化时遇到困难,无法去除大部分杂带,这可能与串联基因过多有关2.两种融合蛋白特性分析ELISA和Western blot分析显示：两种融合蛋白均能与牛结核分枝杆菌阳性血清发生特异性反应,而与牛副结核病、牛布氏杆菌病、牛巴贝斯病和牛传染性鼻气管炎病阳性血清不反应。热稳定性试验证明两种融合蛋白热稳定性相似,在超过60℃温度处理一小时后,活性迅速降低。两种融合蛋白初步应用于ELISA,分别与本实验室克隆表达的CE蛋白和70-83-CE比较,结果显示,融合蛋白RCE比CE蛋白有更高的敏感性,而R5蛋白则可能由于串联的基因过多,各蛋白结构域互相覆盖部分抗原位点,导致敏感性远低于四联蛋白。说明RCE蛋白作为一种新型的诊断抗原具有良好的应用前景。***蛋白间接ELISA方法的建立和胶体金试纸条的制备通过方阵滴定,确定RCE-ELISA最佳工作条件：抗原的最佳包被浓度为15.625ng/mL,封闭液为5%的脱脂奶粉。一抗1：100倍(体积比)稀释,酶标二抗1：10000倍(体积比)稀释,滴加底物液反应10分钟后0.25%HF终止显色。RCE-胶体金试纸条最佳制备条件：抗原标记胶体金的最佳pH值为8.0,每毫升胶体金溶液中抗原最适标记量为224μg。检测线最佳抗原包被浓度为1.4mg/mL,质控线最佳IgG包被浓度为3.0mg/mL。交叉试验证明试纸条不与牛的其它非相关疾病的阳性血清反应,具有较高的特异性。检测同一份阳性牛血清进行比较实验,结果RCE-胶体金试纸条的敏感性比进口试纸条高4倍,证明其敏感性显著高于进口试纸条。***蛋白间接ELISA和胶体金试纸条在临床牛结核检测中的应用使用RCE-间接ELISA方法检测323份临床牛血清样本,其中TST阳性和阴性样本各为119和204份。ELISA和TST总符合率达到79.57%。RCE较CE蛋白的TST阳性符合率提高了18.49%;RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA多检出阴性样本26份,比CE蛋白的TST阴性符合率提高了12.74%;说明RCE-间接ELISA较CE-间接ELISA具有更高的灵敏度与特异性。用RCE-胶体金试纸条检测301份牛血清,与进口试纸条比较,阳性符合率达到97.78%(88／89),阴性符合率达到95.91%(211／220),总符合率为96.45%(299／310)。说明本研究中的RCE-胶体金试纸条与国际上同类产品具有相似的灵敏度和特异

关键词：牛结核 rv3872 CFP10 ESAT6 诊断抗体

两对混合抗原在ELISA诊断结核分枝杆菌感染中的效果鉴定

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两对混合抗原在ELISA诊断结核分枝杆菌感染中的效果鉴定

作者：张曙光华中农业大学

学位级别：硕士

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的传染病,严重危害人类健康。近年来结核病和HIV的共感染以及多重耐药结核菌株的出现,使得结核病的防治越来越严峻。结核病的早期诊断对结核病的防治意义重大。所以,找到... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)引起的传染病,严重危害人类健康。近年来结核病和HIV的共感染以及多重耐药结核菌株的出现,使得结核病的防治越来越严峻。结核病的早期诊断对结核病的防治意义重大。所以,找到能够特异性诊断结核病的抗原至关重要,但是单独抗原的效果往往不理想。因此,筛选混合抗原成为提升结核病诊断效果的很好选择。我们进行了ELISA实验,筛选能够提高诊断效果的混合抗原,得到了以下结果：(1)筛选到了混合抗原rv1040c+rv2309A和rv2309A+rv3872。本研究采集了86份血清(结核病人71份,健康人15份),分别用单独抗原rv1040c、rv2309A和rv3872以及混合抗原rv1040c+rv2309A和rv2309A+rv3872进行ELISA检测,结果表明两对混合抗原在灵敏度、特异性和精确性方面都优于单独抗原(rv1040c+rv2309A灵敏度80.28%,特异性100%,精确性83.72%;rv2309A+rv3872灵敏度74.65%,特异性100%,精确性79.07%)。(2)通过与商业试剂盒TB-DOT和TB-CHECK-1进行对比,我们发现两对混合抗原在灵敏度、特异性和精确性方面都优于TB-DOT(灵敏度61.97%,特异性73.33%,精确性63.95%),在灵敏度和精确性方面都优于TB-CHECK-1(灵敏度45.07%,精确性54.65%)。综上所述,本研究发现的两对混合抗原rv1040c+rv2309A和rv2309A+rv3872具有更好的结核病诊断能力,在诊断结核病方面有很好的应用前景。

关键词：结核分枝杆菌 ELISA 混合抗原 rv1040c rv2309A rv3872