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基于微流控平台的SARS-CoV-2核酸检测的研究进展

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医疗卫生装备 2024年第1期45卷 101-107页

作者：杨帆王兰邱红孔成张薇薇顾畅朱月蓉东部战区总医院检验科南京210002

介绍了微流控技术的检测原理,综述了基于微流控平台的实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,rt-qpcr)、数字PCR、等温扩增、成簇规律间隔短回文重复序列及其相关... 详细信息

介绍了微流控技术的检测原理,综述了基于微流控平台的实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription quantitative real-time polymerase chain reaction,rt-qpcr)、数字PCR、等温扩增、成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白等技术应用于的SARS-CoV-2核酸检测的研究现状,分析了基于微流控平台的SARS-CoV-2核酸检测的局限性,指出了基于微流控的SARS-CoV-2核酸检测系统在特异度、敏感度、检测限、重复性、信息化、质量控制及试剂成本等方面仍需要进一步的优化改进和临床验证。

关键词：微流控 SARS-CoV-2 核酸检测 rt-qpcr 数字PCR 等温扩增 CRISPR/Cas

m^(6)A去甲基化酶ALKBH5在结直肠癌组织中的差异表达分析

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现代肿瘤医学 2024年第12期32卷 2234-2239页

作者：郑志忠张凌微邱德辉甘秋云福州理工学院生命科学与健康学院福建福州350506 福州载基生物科技有限公司福建福州350028

目的:探讨ALKBH5在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)及其癌旁组织中的差异表达,评估其作为CRC诊断肿瘤标志物的潜在应用。方法:通过GEPIA2数据库和UALCAN网站检索ALKBH5在CRC和癌旁组织中的表达水平,结合PCR和琼脂糖凝胶电泳验证ALKBH5... 详细信息

目的:探讨ALKBH5在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)及其癌旁组织中的差异表达,评估其作为CRC诊断肿瘤标志物的潜在应用。方法:通过GEPIA2数据库和UALCAN网站检索ALKBH5在CRC和癌旁组织中的表达水平,结合PCR和琼脂糖凝胶电泳验证ALKBH5 cDNA引物的特异性,并通过rt-qpcr分析ALKBH5的熔解温度曲线图。结果:ALKBH5在不同癌症中的表达水平和作用功能存在差异,在CRC中的相对表达量较低,而在癌旁组织中则较高,但与患者预后无显著相关性。PCR产物片段大小与ALKBH5 cDNA的121 bp一致,电泳条带清晰且单一,表明引物特异性良好。熔解温度曲线图显示rt-qpcr产物特异性良好,未产生引物二聚体。AUC值为0.945 8,表明ALKBH5具有较高的辅助诊断效能。结论:ALKBH5有望作为CRC诊断的肿瘤标志物,但ALKBH5 mRNA表达量难以单独作为CRC患者治疗靶点,需要综合考虑其表达产物的多样性。

关键词： ALKBH5 结直肠癌 m6A rt-qpcr 表达水平

PRV感染PK-15细胞后相关炎性通路及炎症因子表达变化

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现代畜牧兽医 2024年第2期 9-14页

作者：张王芝舒相华张莹杨广佳全伟储宗秀宋春莲云南农业大学动物医学院云南昆明650201 云南省农村科技服务中心云南昆明650021 昆明金航辰生物科技有限公司云南昆明650501

试验旨在了解猪伪狂犬病毒(PRV)感染宿主后炎症动态变化,以猪肾细胞为宿主,选用炎性通路中Toll样受体4(TLR4)、骨髓分化一级反应蛋白88(MyD88)、核因子kB(NF-kB)和炎症因子干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-... 详细信息

试验旨在了解猪伪狂犬病毒(PRV)感染宿主后炎症动态变化,以猪肾细胞为宿主,选用炎性通路中Toll样受体4(TLR4)、骨髓分化一级反应蛋白88(MyD88)、核因子kB(NF-kB)和炎症因子干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)为研究指标。通过PRV感染PK-15细胞和BHK-21细胞,对比分析两者细胞感染量(TCID_(50))、细胞病变(CPE)和病毒载量;选取PRV较敏感细胞,设计炎性通路因子特异性引物,用实时荧光定量PCR检测不同时间点TLR4、MyD88和NF-kB表达量,ELISA测定IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-1β和IL-6炎症因子含量。结果显示,PK-15细胞、BHK-21细胞的TCID_(50)分别为10^(-8.98)/0.1 mL和10^(-8.58)/0.1 mL;在感染PRV第18 h均见典型CPE。PK-15细胞病毒载量较高,且18 h内PK-15的CPE程度与病毒载量呈正相关。与未感染的PK-15细胞相比,PRV感染PK-15细胞后TLR4、MyD88和NF-kB表达量均在感染后0~6 h时升高,感染后第12 h时极显著降低(P<0.01);除IFN-β外的炎症因子含量总体呈先下降后上升趋势。研究表明,PRV感染宿主过程中可引起TLR4-MyD88-NF-kB通路表达量升高,促进炎症因子变化抵抗病毒感染,TLR4-MyD88-NF-kB炎症通路在抗PRV感染过程中发挥重要作用。

关键词： PRV PK-15细胞炎症通路炎症因子 rt-qpcr

Real time rt-qpcr检测规范化

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中国生物工程杂志 2010年第10期30卷 55-59页

作者：马俊彦林俊浙江大学附属妇产科医院浙江省女性生殖健康重点实验室杭州310006

Real time rt-qpcr(real-time quantitative reverse transcription-PCR)是一种快速、简便、准确、灵敏、成本低廉的基因检测技术,被认为是目前检测基因在转录水平表达的金标准。研究发现Real time rt-qpcr的检测结果会受到实验设计、... 详细信息

Real time rt-qpcr(real-time quantitative reverse transcription-PCR)是一种快速、简便、准确、灵敏、成本低廉的基因检测技术,被认为是目前检测基因在转录水平表达的金标准。研究发现Real time rt-qpcr的检测结果会受到实验设计、引物、模板的质量、内参的选择及数据分析的方法等多个因素的影响,规范实验设计及操作是得到可靠结论的前提和必要条件。对近年来国内外涉及Real time rt-qpcr整个实验流程及数据发表的一些规范及标准进行综述,以便规范实验设计及操作,加强实验质量控制,促进研究结果的推广,和更好地发挥其应用价值。

关键词： Real time rt-qpcr 规范化基因表达

一种快速简便的伪狂犬病毒EP0基因rt-qpcr检测方法的构建

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中国动物传染病学报 2021年

作者：张丽荣阮可悦童武李国新高飞单同领于海童光志郑浩中国农业科学院上海兽医研究所

伪狂犬病病毒EP0基因编码区与病毒长的潜伏相关转录物（long latent transcript，LLT）互补，这干扰了EP0基因表达的定量分析。本研究根据新近证实的EP0剪接体的序列，设计合成一对特异性引物，以GAPDH作为内参，建立一种SYBR Green 实... 详细信息

伪狂犬病病毒EP0基因编码区与病毒长的潜伏相关转录物（long latent transcript，LLT）互补，这干扰了EP0基因表达的定量分析。本研究根据新近证实的EP0剪接体的序列，设计合成一对特异性引物，以GAPDH作为内参，建立一种SYBR Green 实时荧光定量PCR检测EP0表达。提取PRV感染细胞的总RNA，分析了DNaseⅠ消化处理、不同反转录引物对检测结果的影响，并且利用该方法检测了EP0基因在感染细胞中的表达特征。结果显示：建立的rt-qpcr溶解曲线单一，且重复性好；PRV基因组DNA不影响rt-qpcr的检测，总RNA不经过DNaseⅠ消化可直接用于EP0的表达检测；随机引物比Oligo（dT）更适合用于反转录，能获得更灵敏的EP0检测结果；EP0基因在感染细胞8h后表达量达到最高。小鼠三叉神经组织EP0定量检测发现LLT启动子缺失病毒与亲本病毒相比表达量明显降低。上述结果显示，本文成功建立了检测伪狂犬病病毒EP0基因快速简便的方法，为EP0基因的研究提供了有力手段。

关键词：伪狂犬病病毒 EP0基因 rt-qpcr

着丝粒蛋白A在膀胱癌组织中的表达及临床意义

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现代肿瘤医学 2024年第13期32卷 2424-2427页

作者：翟雨晴汪煜琳曹文静张宗亮原江水大连医科大学辽宁大连116041 青岛市市立医院检验科山东青岛266011 青岛大学山东青岛266011 青岛大学附属医院泌尿外科山东青岛266011

目的:检测着丝粒蛋白A(centromeric protein A,CENP-A)在膀胱癌组织中的mRNA和蛋白表达水平,分析其临床意义及与患者临床病理特征的相关性。方法:rt-qpcr技术检测30例膀胱癌患者外周血单个核细胞中CENP-A mRNA的表达水平;免疫组化方法检... 详细信息

目的:检测着丝粒蛋白A(centromeric protein A,CENP-A)在膀胱癌组织中的mRNA和蛋白表达水平,分析其临床意义及与患者临床病理特征的相关性。方法:rt-qpcr技术检测30例膀胱癌患者外周血单个核细胞中CENP-A mRNA的表达水平;免疫组化方法检测45例膀胱癌组织中CENP-A蛋白的表达水平及其与临床病理特征的关系;ROC曲线分析CENP-A蛋白表达情况对于膀胱癌的诊断价值。结果:与对照组相比,膀胱癌组织中CENP-A的mRNA及蛋白表达显著上调,CENP-A的表达量与年龄、性别等无相关性,与肿瘤分期及肿瘤恶性程度呈正相关。对其进行ROC曲线分析,发现CENP-A对膀胱癌诊断的敏感度和特异度较高,具有较好的临床价值。结论:CENP-A在膀胱癌组织中表达上调且与膀胱癌患者的分期情况相关,可能成为膀胱癌精准分子诊断的潜在靶基因,在其诊断治疗中发挥重要的作用。

关键词：着丝粒蛋白A 膀胱癌 rt-qpcr 免疫组化

马铃薯纺锤块茎类病毒rt-qpcr检测技术体系的建立

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作物杂志 2020年第3期 79-84页

作者：邱彩玲范国权申宇高艳玲张威韩树鑫张抒董学志马纪白艳菊黑龙江省农业科学院马铃薯研究所/农业农村部脱毒马铃薯种薯质量监督检验测试中心(哈尔滨) 黑龙江哈尔滨150086 黑龙江省农垦科学院植物保护研究所黑龙江哈尔滨150000

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)是马铃薯生产中的一种重要病害,目前主要通过使用脱毒种薯及隔离措施来防控,探索高效、灵敏、特异性强的检测技术对于防治该病害具有重要意义。设计了3组引物,1条探针,从3组引物中筛选出最优组合,并以他们... 详细信息

马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)是马铃薯生产中的一种重要病害,目前主要通过使用脱毒种薯及隔离措施来防控,探索高效、灵敏、特异性强的检测技术对于防治该病害具有重要意义。设计了3组引物,1条探针,从3组引物中筛选出最优组合,并以他们为引物,以PSTV 251T为探针,利用5′FAM、3′TAMRA标记,建立了PSTVd的rt-qpcr检测技术体系。利用该检测体系成功地检测了22份马铃薯样本。与灵敏度相对较高的rt-PCR技术相比,该检测技术体系的检测灵敏度又提升了100~1000倍。

关键词：马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd) rt-qpcr 检测技术

双重rt-qpcr鉴别CSFV和BVDV方法的建立及初步应用

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中国兽医杂志 2018年第5期54卷 28-31,35页

作者：韦雪华张向东谢之景田夫林王贵升山东农业大学动物科技学院山东泰安271018 北京森康生物技术开发有限公司北京怀柔101400 山东省动物疫病预防与控制中心山东济南250022

为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重rt-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测... 详细信息

为建立猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的鉴别检测方法,本研究根据CSFV Npro基因、BVDV 5'-UTR基因保守区域设计特异性引物和Taq Man探针,构建阳性重组质粒,优化反应条件,建立了双重rt-q PCR检测方法。该方法 CSFV和BVDV的检测灵敏度均为100拷贝/μL,具有良好的特异性和重复性;对206份猪病料进行检测,CSFV阳性59份、BVDV皆为阴性,与本实验室常用单项rt-q PCR试剂盒检测结果一致。本研究建立的双重rt-q PCR整个检测过程不到3 h,采取闭管反应,检测完毕直接处理,避免开盖造成气溶胶污染,具有简单、快捷、灵敏度高、生物安全性好等优点,可用于CSFV和BVDV的临床鉴别检测,为2种病毒的交叉污染的检测提供一种方便、快捷的方法。

关键词： rt-qpcr CSFV BVDV

寨卡病毒ddPCR和rt-qpcr检测方法的建立及B细胞线性表位分析

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寨卡病毒ddPCR和RT-qPCR检测方法的建立及B细胞线性表位分析

作者：惠媛南方医科大学

学位级别：硕士

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)... 详细信息

背景寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)为单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)。最初是1947年在乌干达森林里分离的,通过蚊虫叮咬传播,特别是埃及伊蚊和白纹伊蚊。ZIKV感染者的临床表现包括轻度发烧(37.8-38.5℃)、关节疼痛(尤其是手和脚疼痛)、肌痛、头痛、眼眶疼痛、结膜炎、皮疹,还可引起小头畸形和Guillain-Barre综合症。ZIKV编码3个结构蛋白(衣壳蛋白C、前体蛋白prM、包膜蛋白E)和7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和 NS5)。对于ZIKV检测,主要有血清学检测和核酸分子检测两种方法。由于寨卡病毒和其他黄病毒存在交叉反应抗原,在同时存在其它黄病毒的流行区,血清学检测可能产生假阳性结果。现有的量化核酸检测方法在检测极低病毒浓度的血清样本时,敏感性和准确性受到一定限制。微滴式数字聚合酶链式反应(Micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)是一种新的分子检测方法,它和rt-qpcr使用相同的引物和探针,但不需要外部标准曲线或参考就能精确地检测和量化核酸。近年来,ddPCR在医学检验、环境监测和食品安全控制中的应用越来越多,但尚未有在ZIKV检测中应用的报道。本论文第一部分拟建立基于寨卡病毒NS5基因的ddPCR和rt-qpcr方法,对比它们的灵敏度和特异性,旨在为检测低滴度和/或寨卡病毒早期感染提供更准确性的方法。接种疫苗预防寨卡病毒感染最有效的方法。但是目前尚没有批准上市的寨卡疫苗,寨卡疫苗的研发迫在眉睫。B细胞抗原表位是指抗原分子表面可被B细胞表面受体(B cell receptor,BCR)或抗体Fab部分特异性识别并结合的化学基团,是引起体液免疫的物质基础。B细胞抗原表位作为抗原的核心部分,是研究免疫诊断和免疫治疗的重点,对它的生物信息学预测可以节约实验室工作量,在一定程度上避免传统表位研究的盲目性。各种研究表明,表位驱动疫苗能够有效地刺激多种病原体的保护性免疫反应,如流感病毒、人类免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒。B细胞抗原表位的鉴定对于表位疫苗的发展很重要,免疫信息学在疫苗开发领域正变得越来越重要,该领域利用基因组和蛋白质组的信息,为预测潜在的候选疫苗提供了高质量的信息。本文第二部分拟通过对寨卡病毒Z16006株蛋白序列抗原性预测、基本理化性质和二级结构分析预测B细胞抗原表位,最终得出寨卡病毒蛋白B细胞优势表位区段。应用多参数方法预测寨卡病毒蛋白B细胞表位,为进一步实验鉴定其表位进而制备单克隆抗体奠定基础。目的建立寨卡病毒微滴式数字 PCR(micro-droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)和实时荧光定量 PCR(real-time quantification PCR,rt-qpcr)检测技术,并评估两种方法的检测范围、灵敏度和重复性。运用生物信息学的方法,发现寨卡病毒Z16006株全长蛋白潜在的B细胞线性抗原表位。方法对于ddPCR方法的建立,首先使用软件设计寨卡病毒NS5基因的引物和探针,制备质粒标准品,建立rt-qpcr以及ddPCR方法,并比较两种检测方法的灵敏性和准确性。以本科室现有的寨卡病毒株Z16006(Accession:AMR39830.1)为研究对象,从NCBI上获得Z16006蛋白序列,用在线软件VaxiJen v2.0对其抗原性进行评分,在ProParam软件中分析Z16006蛋白序列的基本理化性质,利用SOPMA软件进行二级结构预测,随后通过IEDB软件和ABCpred在线服务器对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白序列B抗原表位进行预测分析。结果1.基于寨卡病毒NS5基因设计PCR引物和探针,使用rt-q PCR对质粒标准品进行检测,其标准曲线R2为0.999,扩增效率为92.203%,在101-108 copy/μL范围内循环阈值(the cycle threshold value,Ct)和拷贝数有比较好的线性关系,但是浓度为1 copy/μL的样品不能被检测到。DdPCR线性范围从101-104 copy/μL,并且可以检测浓度低至1 copy/μL的样品。对于临床阳性血液样品,rt-qpcr适合高浓度样品(101 copy/μL),ddPCR对于低拷贝数样品具有良好的准确性和敏感性。2.应用VaxiJen v2.0、ProtParam服务器、SOPMA、IEDB生物信息学服务器、ABCpred在线服务器,对寨卡病毒Z16006株蛋白各蛋白表位参数综合分析来预测了 B细胞表位。共预测分析得出52个B细胞潜在优势抗原表位。结论:1.本研究建立了两种检测寨卡病毒的方法,rt-qpcr对于高浓度样品(101 copy/μL以上)具有良好的

关键词：寨卡病毒 NS5基因核酸检测 ddPCR rt-qpcr B细胞线性表位