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rt-rpa结合CRISPR/Cas12a的POCT技术研究及在诺如病毒分型检测中的应用

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RT-RPA结合CRISPR/Cas12a的POCT技术研究及在诺如病毒分型检测中...

作者：方坛芬苏州大学

学位级别：硕士

目的:本研究将一步法逆转录重组酶聚合酶常温扩增(Reverse transcription recombinase polymerase amplification,rt-rpa)与成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated protein,CRISPR/Cas)核酸检测系统相结合,旨在研发一种对诺如病毒(Noroviruses,NoVs)基因组 Ⅰ 型(GenogroupⅠ,GⅠ)和 Ⅱ 型(GenogroupⅡ,GⅡ)分型的现场即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术。方法:(1)标准质粒的制备。比对GⅠ、GⅡ各亚型No Vs的基因组序列,选择本方法的检测靶标,并制备阳性质粒模板。(2)rt-rpa体系的建立。设计、筛选GⅠ、GⅡ型NoVs的rpa引物,并优化rt-rpa体系。(3)CRISPR/Cas检测体系的建立。设计、筛选GⅠ、GⅡ型NoVs的特异性CRISPR RNAs(crRNAs),并优化CRISPR/Cas检测体系。(4)rt-rpa-CRISPR/Cas12a分型检测方法的建立。整合前置扩增和CRISPR/Cas检测体系,构建分型检测方法,并考察方法的特异性、灵敏度以及临床样本检测效果。(5)微流控芯片的设计和应用。在rt-rpa-CRISPR/Cas12a检测方法的基础上设计微流控芯片并应用于样本检测。结果:(1)本研究选择 NoVs 的 RNA 聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)与衣壳蛋白(Virusparticle 1,VP1)基因的连接处作为检测靶标,并构建了GⅡ.4、GⅡ.3以及GI.1型NoVs质粒模板。(2)本研究成功筛选出GⅠ、GⅡ型NoVs的高效rpa引物,并通过在rt-rpa体系中添加特异性rt引物和优化引物浓度改善rt-rpa体系的扩增效率。(3)本研究成功筛选出了 GⅠ、GⅡ型NoVs的特异性crRNAs,建立并优化了 CRISPR/Cas体系,可在紫外下目视观察阳性样品的荧光信号。(4)本研究成功建立了针对NoVs分型的rt-rpa-CRISPR/Cas12a检测体系。该体系只对GⅠ、GⅡ型NoVs产生荧光检测信号,与轮状病毒和肠道腺病毒这些常见胃肠炎病毒均无交叉反应,并能区分GⅠ和GⅡ两种基因型,而未发生脱靶现象。本方法对GⅠ、GⅡ型NoVs质粒的检测灵敏度分别能达到10 copies/μL和1 copy/μL。本方法对收集的7份NoVs临床阳性样本的检测结果与实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,rt-qPCR)方法一致。值得注意的是,循环阈值(Cycle threshold,Ct)为35的GⅡ样本和Ct值为30的GI样本均能被检出,并且检测出的阳性样本中涵盖多个基因亚型。(5)本研究中设计的微流控芯片技术能够应用于样本检测,在紫外下目视观察检测结果。结论:本研究成功构建了一种rt-rpa结合CRISPR/Cas12a的POCT技术,在37℃恒温条件下,35min内,对NoVs进行特异、灵敏的分型检测,检测对象覆盖GⅠ、GⅡ基因组的各个亚型,对GⅠ、GⅡ型NoVs质粒的检测灵敏度分别达到10 copies/μL和1 copy/μL,临床样本检测结果与rt-qPCR方法一致。本方法能实现对疑似患者和密接人群的POCT诊断和筛查,对于NoVs疫情的及时确认和控制具有重要意义。此外,对GⅠ、GⅡ型NoVs分型诊断为临床提供更精准的诊疗依据。

关键词：诺如病毒 rt-rpa CRISPR/Cas12a POCT

鹿流行性出血热病毒实时荧光rt-rpa检测方法的建立

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中国兽医科学 2019年第12期49卷 1492-1498页

作者：林彦星花群俊史卫军黄超华曹琛福张彩虹阮周曦曾少灵杨俊兴花群义深圳海关动植物检验检疫技术中心云南省武定县动物疫病预防控制中心

为建立一种快速检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)的实时荧光rt-rpa检测方法,本研究根据EHDV保守的非结构蛋白NS1基因(segment 5)设计特异性引物和探针,建立了敏感、快速的EHDV核酸实时荧光rt-rpa检测方法。结果显示,该方法特异性强,能准确... 详细信息

为建立一种快速检测鹿流行性出血热病毒(EHDV)的实时荧光rt-rpa检测方法,本研究根据EHDV保守的非结构蛋白NS1基因(segment 5)设计特异性引物和探针,建立了敏感、快速的EHDV核酸实时荧光rt-rpa检测方法。结果显示,该方法特异性强,能准确检测EHDV核酸,与蓝舌病病毒(BTV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原核酸无交叉反应;敏感性高,本试验中最低可检测到8×10~1copies/μL;检测时间短,仅需15 min;重复性好。采用所建立方法对115份样品进行检测,结果与OIE推荐的实时荧光rt-PCR法检测结果相同。上述结果表明,本研究建立的实时荧光rt-rpa快速检测法操作简便,可用于基层实验室快速检测。

关键词：鹿流行性出血热病毒 rt-rpa 快速检测

梨褪绿叶斑伴随病毒rt-rpa与rt-qPCR检测及电疗脱除技术研究

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梨褪绿叶斑伴随病毒RT-RPA与RT-qPCR检测及电疗脱除技术研究

作者：朱宜庭华中农业大学

学位级别：硕士

梨褪绿叶斑伴随病毒(Pear chlorotic leaf spot-associated virus,PCLSaV)是我国近年新鉴定出的一种负义RNA病毒,属于欧洲山梣环斑病毒属(Emaravirus),其基因组至少由5条负义单链RNA组成。由PCLSaV引起的梨褪绿叶斑病(pear chlorotic leaf spot,PCLS)在我国局部砂梨产区发生普遍,严重影响梨的生长。本研究建立了PCLSaV的逆转录重组酶聚合酶扩增(rt-rpa)技术以及实时荧光定量rt-PCR(rt-qPCR)技术;采用茎尖培养、电疗处理与化学处理结合的方法,进行该病毒脱除研究,建立了实用的脱毒技术体系。研究结果为该病毒病害的早期诊断和无病毒种质培育提供了技术支撑。取得的主要研究结果如下:***的rt-rpa检测。基于PCLSaV的RNA3链和RNA5链的序列设计了7对引物,采用常规rt-PCR筛选出特异性较好的引物R3-F1/R1。对带有不同病毒的梨叶片样品进行rt-rpa分析,仅从PCLSaV阳性样品中扩增到大小为243bp的目的条带,即该引物特异性良好。rpa方法可检测到稀释数为10倍的含该病毒RNA3部分片段序列的质粒,灵敏度与PCR相当。对38份田间梨叶片和32份梨离体植株叶片样品进行检测,rt-rpa方法检出了37份阳性样品,检出率为52.9%;rt-PCR方法检出了41份阳性样品,检出率为58.6%,两种方法检测结果一致率为91.4%。rt-rpa所需设备简单,反应速度快,只需在39℃下反应20 min,可用于该病毒的快速检测。***的rt-qPCR检测。基于PCLSaV的RNA3和RNA5链的序列设计了8对引物,经常规rt-PCR和rt-qPCR分析筛选出特异性较好的引物q5-F2/R2,优化了rt-qPCR的引物用量和退火温度。建立了标准曲线,循环Ct值与模板浓度线性关系良好(R=0.997),扩增效率为91.9%。该方法对PCLSaV特异性强,与其他常见的梨病毒无交叉反应。检测质粒的灵敏度为3.0×10拷贝/μL,是常规PCR的10倍。研究发现PCLSaV在梨植株上分布不均匀,梨病株的不同样品中PCLSaV的含量存在显著差异,发病叶片中的病毒拷贝数相对较高,不显症枝条的韧皮部中病毒拷贝数最低。同一病枝上的嫩叶中PCLSaV含量高于老叶,其中表现褪绿斑点和坏死症状的顶端嫩叶中病毒拷贝数最高,无症状的下部老叶中病毒拷贝数最低。对32份田间梨叶片和46份梨离体植株叶片样品进行检测,在23份有症状叶片中,rt-qPCR和rt-PCR分别检出23份和22份阳性样品;在55份无症状叶片中,rt-qPCR和rt-PCR分别检出19份和13份阳性样品。3.梨离体植株中PCLSaV的脱除。以砂梨‘丰水’离体植株为试验材料,比较了4种方法脱除PCLSaV的效果。结果显示,茎尖培养、病毒醚处理结合茎尖培养、电疗处理结合茎尖培养以及病毒醚加电疗处理结合茎尖培养这4种方法脱除PCLSaV的效率分别为30.0%、47.4%、44.4%以及76.5%。采用病毒醚加电疗处理结合茎尖培养对其他4个梨品种离体植株中的PCLSaV、ASGV和ASPV进行脱除试验的结果显示,‘康弗伦斯’植株中PCLSaV的脱除率为85.7%,‘康弗伦斯’、‘巴梨’和‘色尔克甫’植株中ASGV的平均脱除率为52.3%,‘康弗伦斯’和‘金香水’植株中的ASPV脱除率为100%。本研究首次将电疗处理用于梨病毒的脱除,为梨无病毒种质培育提供了新的技术支撑。

关键词：梨离体植株梨褪绿叶斑伴随病毒 rt-rpa rt-qPCR 病毒脱除电疗法

建立双重rt-rpa方法检测猪δ冠状病毒和猪流行性腹泻与猪δ冠状病毒单克隆抗体的制备

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建立双重RT-RPA方法检测猪δ冠状病毒和猪流行性腹泻与猪δ冠状病...

作者：李根华南农业大学

学位级别：硕士

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)又称猪D型冠状病毒为带有囊膜的正链单股RNA病毒,属于尼多目、冠状病毒科、δ冠状病毒属成员。猪感染后表现为采食量下降、呕吐、水样腹泻和脱水等临床症状,严重时会致死,可以感染各个年... 详细信息

猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus,PDCoV)又称猪D型冠状病毒为带有囊膜的正链单股RNA病毒,属于尼多目、冠状病毒科、δ冠状病毒属成员。猪感染后表现为采食量下降、呕吐、水样腹泻和脱水等临床症状,严重时会致死,可以感染各个年龄阶段的猪,尤其是肠道发育不全的新生仔猪。此外PDCoV、猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Porcine transmissible gastroenteritis,TGEV)、猪急性腹泻病毒(Porcine acute diarrhea syndrome,SADS-CoV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus,Po RV)等猪病毒性腹泻病原体在临床上引发相似的症状,而且常常会出现混合感染的情况,所以很难对该病进行防控和检测。2012年在中国香港首次发现PDCoV,2014年在美国流行爆发,目前已遍及全世界,呈全球流行趋势。对生猪健康以及生猪养殖业造成了极大地威胁,有研究表明可能对人类的健康也会有潜在影响。本试验根据PDCoV和PEDV保守区域设计引物并建立了一种双重逆转录重组酶介导的核酸扩增(Reverse transcription-recombinase polymerase amplification,rt-rpa)检测方法。从Gen Bank中下载多条序列并用Meg Align进行对比分析挑选保守序列,设计rpa引物进行双重rt-rpa试验对引物进行筛选,并对反应条件和体系进行优化,结果表明最佳反应条件为39.0℃,恒温扩增40 min,引物比例1:1,建立的方法具有良好的特异性,最低检测值为100 copies/μL,优于rt-PCR。对19份粪便样品和26份肠道样品共45份临床样品进行检测,其中PDCoV为阳性的样品4份,阳性率为8.89%(4/45),其中粪便样品2份(2/19),肠道样品2份(2/26);PEDV为阳性的样品13份(13/45),阳性率为28.89%,其中粪便样品6份(6/19),肠道样品7份(7/26);一份粪便样品中同时检测出PEDV和PDCoV。与rt-PCR检测方法阳性检出率一致,证明了该方法可用于现场检测,且效果较好,具有应用前景。此外本文还构建了pET-32a-PDCoV-N重组表达载体,预测重组蛋白大小为61.6k Da,通过SDS-PAGE和Western-blot进行验证。确定了蛋白表达最佳诱导的条件,纯化诱导表达后的蛋白并对其进行浓度测定,每次将抗原蛋白与佐剂1:1稀释成0.3mg/m L共100μL,免疫BALB/c小鼠,确定小鼠内血清抗体效价到达1:10000后,将骨髓瘤细胞(SP2/0)和小鼠脾细胞进行细胞融合,间接ELISA方法对阳性杂交瘤细胞筛选。再通过有限稀释法获得可稳定分泌抗N蛋白抗体的阳性杂交瘤细胞2株,分别命名为#25和#73。对效价高的#73进行IFA试验和Western-blot试验检验,均可与PDCoV发生免疫反应,用其他常见猪腹泻病毒PEDV、TGEV、SADS-CoV和Po RV验证特异性,结果显示没有交叉反应,特异性良好。用PDCoV阳性猪作为临床样品,并对空肠做病理切片进行组织IFA试验,显示所制备的单抗效果好,能特异性的与病毒结合显色。综上所述,本次研究建立了PEDV和PDCoV的双重rt-rpa检测方法,能够快速对这两种病毒进行鉴定;同时,本研究基于PDCoV的N基因序列构建蛋白表达载体表达重组N蛋白,并以此制备了特异性的单克隆抗体。本研究的成果可以为PDCoV的诊断研究和N蛋白的结构功能研究提供相关依据和物质基础。

关键词：猪δ冠状病毒(PDCoV) rt-rpa N蛋白单克隆抗体

戊型肝炎病毒rt-rpa快速检测方法的建立与应用评价

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现代畜牧兽医 2020年第5期 15-19页

作者：娄成王家英燕阳刘圆陈雪娇姜婷婷李阳高慎阳锦州医科大学畜牧兽医学院辽宁锦州121001

在建立高效快速检测猪肝样品中戊型肝炎病毒(HEV)的rt-rpa检测新方法并调查分析锦州市零售猪肝中HEV的污染情况。试验以基因4型HEV参考毒株的ORF2/3保守序列为靶序列设计符合rpa检测的特异性引物,建立HEV rt-rpa检测方法,并评估该方法... 详细信息

在建立高效快速检测猪肝样品中戊型肝炎病毒(HEV)的rt-rpa检测新方法并调查分析锦州市零售猪肝中HEV的污染情况。试验以基因4型HEV参考毒株的ORF2/3保守序列为靶序列设计符合rpa检测的特异性引物,建立HEV rt-rpa检测方法,并评估该方法的敏感性及特异性。使用该方法与目前HEV RNA检测金标准rt-qPCR方法对锦州市零售猪肝中的HEV RNA进行同步对比检测,并配合HEV IgM ELISA检测,最终综合统计分析锦州市零售的猪肝被HEV污染的情况。结果显示,本次研究成功建立了HEV rt-rpa检测方法,该方法在39℃恒温条件下30 min即能完成扩增,具有良好的敏感性和特异性。本次研究共收集猪肝样品358份,HEV RNA阳性检出率为0.6%(2/358),该结果与参考方法一致。HEV IgM阳性检出率为44.13%(158/358)。试验结果表明,说明锦州市零售猪肝中普遍存在HEV污染。虽然在屠宰上市后的猪肝样品中检测到HEV RNA的概率较低,但仍然提示本地生猪产业链中HEV流行普遍,因此需要做好公共卫生防范。

关键词： HEV 生猪肝 rt-rpa ELISA 污染情况

常见呼吸道感染用药对rt-rpa方法检测SARS-CoV-2的影响

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江苏海洋大学学报（自然科学版） 2021年第2期30卷 72-76页

作者：吴芳张雅琪张建张新亚许恒皓张胜胜赵琰薛勇罗志丹江苏海洋大学药学院江苏连云港222005 江苏省海洋生物产业技术协同创新中心江苏连云港222005

实验考察新型冠状病毒肺炎患者在治疗之前和治疗期间服用的常见呼吸道感染用药是否会对rt-rpa检测结果产生影响,以及常用呼吸道感染用药在最大血清浓度下对rt-rpa检测方法的影响。通过载体构建制备SARS-CoV-2病毒RNA模板,进而筛选相关... 详细信息

实验考察新型冠状病毒肺炎患者在治疗之前和治疗期间服用的常见呼吸道感染用药是否会对rt-rpa检测结果产生影响,以及常用呼吸道感染用药在最大血清浓度下对rt-rpa检测方法的影响。通过载体构建制备SARS-CoV-2病毒RNA模板,进而筛选相关药物及药物溶液制备,最后建立了SARS-CoV-2的rt-rpa检测体系,并评估了常见呼吸道感染用药(布地奈德鼻腔喷雾剂、磷酸奥司他韦胶囊、利巴韦林颗粒、阿奇霉素分散片、盐酸左氧氟沙星胶囊和醋酸地塞米松片)对rt-rpa方法检测SARS-CoV-2的影响。实验结果表明,6种常见呼吸道感染用药中,布地奈德、磷酸奥司他韦、盐酸左氧氟沙星和醋酸地塞米松4种药物对rt-rpa存在轻微影响或无影响,在临床中用于单独用药或组合治疗的阿奇霉素和利巴韦林,则分别会对rt-rpa反应产生抑制和促进作用。由此得出,在使用rt-rpa方法检测SARS-CoV-2时需要考虑患者的用药史。

关键词： rt-rpa SARS-CoV-2 呼吸道感染用药诊断

猪瘟病毒重组酶聚合酶扩增检测方法的建立及应用

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中国兽医科学 2019年第6期49卷 687-693页

作者：王金凤张若曦刘立兵李睿文孟令宅顾文源韩庆安王建昌袁万哲河北省检验检疫科学技术研究院河北石家庄050051 河北省动物疫病预防控制中心河北石家庄050035 河北农业大学动物医学院河北保定071001 石家庄海关技术中心河北石家庄050051

本研究基于猪瘟病毒(CSFV)5’UTR保守序列,设计特异性引物,建立了可快速检测CSFV的反转录重组酶聚合酶扩增检测方法(reverse-transcription recombinase polymerase amplification,rt-rpa)。该方法在40℃下恒温20 min即可完成反应;且特异性强,与其他瘟病毒和猪的重要病原无任何交叉反应。以体外转录的CSFV RNA为模板,该方法的检出下限为10~2copies。采用rt-rpa方法和实时荧光rt-PCR(real-time rt-PCR)方法同时对57份临床样品进行CSFV检测,结果,rt-rpa方法的阳性检出率为56.14%(32/57),略低于real-time rt-PCR方法的阳性检出率(64.19%,37/57)。以real-time rt-PCR作为参考方法,所建立的rt-rpa方法的诊断特异性为100%,诊断灵敏度为89.19%。上述结果表明,本研究建立的CSFV rt-rpa检测方法操作简单、反应快速,对没有装备荧光PCR仪地区的猪瘟诊断防控具有重要意义。

关键词：猪瘟病毒 5’UTR rt-rpa 等温扩增

基于重组酶聚合酶扩增技术的犬冠状病毒快速检测方法的建立

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中国兽医杂志 2020年第3期56卷 88-90,94页

作者：陈坚张丹琳马磊伍妙梨广西柳州畜牧兽医学校广西柳州545003 广东省实验动物监测所广东广州510633

为建立一种快速、简便检测犬冠状病毒(CCoV)的方法,本试验基于犬冠状病毒M基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了CCoV的重组酶聚合酶扩增检测方法(rt-rpa)。试验结果表明,所建立的rt-rpa方法在35℃恒温反应15 min即可... 详细信息

为建立一种快速、简便检测犬冠状病毒(CCoV)的方法,本试验基于犬冠状病毒M基因的保守区域设计特异性引物,通过优化反应条件,建立了CCoV的重组酶聚合酶扩增检测方法(rt-rpa)。试验结果表明,所建立的rt-rpa方法在35℃恒温反应15 min即可检测出100个拷贝的体外转录RNA,且与犬的其他常见病毒,如犬瘟热病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒等,无非交叉反应,表明所建立的CCoV rt-rpa具有良好的特异性及较高的敏感性。使用rt-rpa对25份临床样品的检测结果显示,CCoV的检出率为48%(12/25),该结果与荧光定量PCR的检测结果完全一致。表明本试验所建立的CCoV rt-rpa检测方法操作简单、反应快速灵敏,适用于CCoV的快速检测。

关键词：犬冠状病毒 rt-rpa 快速检测

北京地区菊花病毒病调查及高效检测方法的建立

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北京地区菊花病毒病调查及高效检测方法的建立

作者：王森河北农业大学

学位级别：硕士

菊花(Chrysanthemum morifolium)作为我国传统名花、重要的中草药植物以及世界四大切花之一,具备食用、药用、观赏等多种经济价值。病毒病是菊花生长过程中的重要病害,会使菊花出现花叶、黄叶、褪绿斑、枯斑、坏死斑以及植株矮化、畸形... 详细信息

菊花(Chrysanthemum morifolium)作为我国传统名花、重要的中草药植物以及世界四大切花之一,具备食用、药用、观赏等多种经济价值。病毒病是菊花生长过程中的重要病害,会使菊花出现花叶、黄叶、褪绿斑、枯斑、坏死斑以及植株矮化、畸形、不孕等症状,严重影响菊花的正常生长,造成其产量及品质的下降。本研究调查了北京地区菊花病毒病的种类及分布特征,并建立了 3种主要病毒的反转录重组酶聚合酶等温扩增(Recombinase polymerase amplification,rpa)检测体系;同时,建立了 3种病毒和2种类病毒的多重rt-PCR检测体系。主要研究结果如下:(1)对北京平谷区、顺义区、延庆区3个地区的菊花病毒病发生情况进行了调查。菊花感染病毒及类病毒的主要症状有:早花,花器官畸形,茎条状黑斑,花叶、叶片皱缩、黄化、畸形、紫脉以及植株矮化等,其中叶片黄化的比例最高。(2)采集疑似感染病毒病的菊花样本累计66个,针对国内常见的7种病毒和2种类病毒,利用rt-PCR法进行了检测,结果共检测到3种病毒和2种类病毒,分别是番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、菊花B病毒(Chrysanthemum virus B,CVB)、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus,TAV)、菊花褪绿斑驳类病毒(Chrysanthemum chlorotic mottle viroid,CChMVd)和菊花矮化类病毒(Chrysanthemum stunt viroid,CSVd)。其中,检出率最高的病毒种类是CVB,高达96.97%,其次,检出率由高到低的病毒及类病毒种类依次是CSVd、CChMVd、TSWV、TAV,检出率分别为90.91%、89.39%、65.15%、33.33%。在检测的样本中,多种病毒(类病毒)复合感染的情况普遍存在,复合感染的检出率高达100%,3种病毒及2种类病毒共检测出12种复合感染组合,其中TSWV、CVB、CSVd和CChMVd复合感染的情况最为常见,占比高达30.30%;TSWV、CVB、TAV、CSVd和CChMVd 3种病毒及2种类病毒的复合感染率也高达25.75%。在顺义区、延庆区和平谷区均检测到3种病毒及2种类病毒,但在不同的地区,菊花复合感染的情况有所不同。(3)为实现病毒的快速检测,针对TSWV、TAV、CVB 3种主要的菊花病毒分别建立了其rt-rpa检测体系。在50 μL的反应体系内依次加入Rehydration buffer 29.5μL,ddH20 11.2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 2.4 μL,模板 cDNA 2.0 μL,MgOAc 2.5 μL。利用构建的rt-rpa体系,3种病毒可以在40℃下,于40 min内完成扩增,简单、快速,特异性良好,且灵敏度性高于单一 rt-PCR。(4)针对北京地区菊花中3种病毒及2种类病毒,建立了其同时检测的多重rt-PCR检测体系。对反应体系中的引物用量组合、模板含量以及PCR反应程序中的退火温度等进行了优化,确定了在20μL的多重rt-PCR反应体系中,TSWV、TAV、CVB、CChMVd、CSVd 的引物用量(10 μmol/L)分别为 0.6 μL、0.1μL、0.4 μL、1.4 μL、1.2 μL,模板cDNA用量为1 μL,退火温度为55.3℃。该方法可同时扩增出片段大小为485 bp、376 bp、292 bp、220 bp、110 bp的目的条带,特异性良好,灵敏度与单一 rt-PCR技术相当。

关键词：菊花病毒类病毒 rt-rpa 多重rt-PCR