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甘薯退绿矮化病毒的rt-pcr检测技术构建

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分子植物育种 2017年第7期15卷 2896-2900页

作者：肖海峻孟利前陈梦然杨春林北京农业职业学院北京102442

随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛。采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RNA,具有灵敏度高、特异性强等优点。在本研究中根据NCBI Gen Bank中收录的SPCSV病毒外壳蛋白(... 详细信息

随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛。采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RNA,具有灵敏度高、特异性强等优点。在本研究中根据NCBI Gen Bank中收录的SPCSV病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了3对特异性引物,使用天根生化科技(北京)有限公司生产的Quant One Step rt-pcr kit试剂盒,针对影响扩增产物的影响因素退火温度进行优化,建立了甘薯退绿矮化病毒的rt-pcr检测方法。该方法使rt-pcr在一管内完成,大大降低了外源物质的污染及RNA降解的几率,可作为甘薯SPCSV病毒的快速检测方法。

关键词：甘薯退绿矮化病毒 rt-pcr检测技术

甘薯羽状斑驳病毒的rt-pcr检测技术构建

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分子植物育种 2019年第13期17卷 4302-4306页

作者：肖海峻孟利前朱建晨张进李庞博黄广学北京农业职业学院

随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction, rt-pcr)在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛,其有灵敏度高、特异性强等优点,采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RN... 详细信息

随着现代分子生物学技术的发展,反转录聚合酶链式反应技术(reverse transcription-polymerase chain reaction, rt-pcr)在甘薯病毒检测上的应用越来越广泛,其有灵敏度高、特异性强等优点,采用该技术可检测出甘薯组织中含量极低的病毒RNA。甘薯羽状斑驳病毒(sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)是导致甘薯发生病害的主要病毒之一,为建立甘薯SPFMV快速检测技术,更好地防止该病毒的发生,本研究根据NCBI GenBank中收录的甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白(CP)基因核苷酸序列的保守区域设计了4对特异性引物,使用天根生化科技(北京)有限公司生产的植物总RNA提取试剂盒、FastQuant cDNA第一链合成试剂盒和2×Taq pcr MasterMix试剂盒,完成特异性引物的筛选并设置不同的退火温度对pcr扩增体系进行优化,确定了甘薯羽状斑驳病毒的rt-pcr检测技术体系。该方法的建立旨在为生产上甘薯SPFMV病毒的快速检测提供技术支持。

关键词：甘薯(Ipomona batatas) 羽状斑驳病毒 rt-pcr检测技术

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葡萄卷叶病毒3 rt-pcr检测技术研究

中国果树 2005年第6期 9-12页

作者：董雅凤张尊平杨俊玲何峻张少瑜中国农业科学院果树研究所辽宁兴城125100

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)rt-pcr检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的pcr,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1... 详细信息

采用改进的二氧化硅吸附法和2组特异性引物进行葡萄卷叶病毒3(GLR aV-3)rt-pcr检测。结果表明,二氧化硅吸附法提取总RNA纯度好、浓度高、操作简便;随机引物合成cDNA能同时用于多种病毒及不同引物的pcr,可简化检测程序,降低检测费用;LC 1/LC 2引物进行rt-pcr检测,病毒检出率高于PU/PD引物和EL ISA方法。建立了规范、灵敏、稳定、快速、经济的GLR aV-3rt-pcr检测技术体系。

关键词：葡萄卷叶病毒3 rt-pcr 检测 rt-pcr检测技术葡萄卷叶病毒特异性引物 ELISA方法二氧化硅总RNA cDNA

荧光rt-pcr与普通rt-pcr检测技术的比较

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新疆畜牧业 2012年第3期27卷 34-35页

作者：兰玲王涛新疆维吾尔自治区动物卫生监督所新疆乌鲁木齐830063

禽流感是威胁新疆养禽业的主要疾病之一,快速检测与诊断、确诊疫情发生与否已成为防控工作的关键。本次试验通过观察荧光pcr与rt-pcr技术检测禽流感（AIV）的敏感性,来比较两种快速诊断技术的应用效果：1实验材料与方法1.1材料1.1.1检... 详细信息

禽流感是威胁新疆养禽业的主要疾病之一,快速检测与诊断、确诊疫情发生与否已成为防控工作的关键。本次试验通过观察荧光pcr与rt-pcr技术检测禽流感（AIV）的敏感性,来比较两种快速诊断技术的应用效果：1实验材料与方法1.1材料1.1.1检测抗原：由哈尔滨兽医研究所提供的禽流感H5亚型血凝抗原,批号20110624。

关键词： rt-pcr检测技术荧光rt-pcr 禽流感H5亚型哈尔滨兽医研究所实验材料诊断技术荧光pcr 快速检测

新发禽流感病荧光rt-pcr检测技术的应用研究

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中国科技成果 2008年第6期9卷 49-49页

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所承担的国家科技攻关计划“新发禽流感病荧光rt-pcr检测技术的应用研究”（2003BA712A03-01）课题，旨在建立一套基于TaqMan-based real-timepcr方法的快速诊断技术，用于禽流感病毒的快速诊断。研... 详细信息

中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所承担的国家科技攻关计划“新发禽流感病荧光rt-pcr检测技术的应用研究”（2003BA712A03-01）课题，旨在建立一套基于TaqMan-based real-timepcr方法的快速诊断技术，用于禽流感病毒的快速诊断。研制针对使人致病的禽流感病毒H5N1、H7N7和H9N2亚型的试剂盒，使其在全国的流感监测、养禽业的禽流感病毒检测以及海关的进出口检验检疫中发挥作用，从而提高我国检测能力以完善我国公共卫生监测体系。课题取得以下主要成绩：

关键词： rt-pcr检测技术禽流感病毒中国疾病预防控制中心应用荧光 real-time 科技攻关计划 H9N2亚型

中国香菇种质资源中两种主要病毒的携带情况检测

维普期刊数据库评论

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菌物学报 2018年第4期37卷 522-537页

作者：王锦杰郭孟配孙艺嘉边银丙徐章逸华中农业大学应用真菌研究所湖北武汉430070 湖北省食用菌工程技术研究中心湖北武汉430070

香菇病毒病通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,但一旦爆发常造成较大经济损失。本文采用rt-pcr检测技术,系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中两种主要病毒Lentinula edodes mycovirus HKB(LeV-HKB)和***... 详细信息

香菇病毒病通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,但一旦爆发常造成较大经济损失。本文采用rt-pcr检测技术,系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中两种主要病毒Lentinula edodes mycovirus HKB(LeV-HKB)和*** partitivirus 1(LePV1)的携带情况。对来源于中国主要栽培省(市)的90个香菇栽培菌株的检测结果表明,有67.8%(61/90)的供试菌株单独或复合感染有LeV-HKB和LePV1中的1种或2种,LeV-HKB病毒携带率56.7%(51/90),明显高于LePV1 35.6%(32/90);栽培菌株两种病毒的复合感染率为24.4%(22/90)。对地理来源几乎覆盖整个中国的125个野生菌株的检测结果表明,有75.2%(94/125)的供试菌株至少感染了LeV-HKB和LePV1中的1种,8.8%(11/125)野生菌株同时感染了两种病毒,且野生菌株中LePV1病毒携带率70.4%(88/125)明显高于LeV-HKB 13.6%(17/125)。栽培菌株和野生菌株中LeV-HKB和LePV1病毒的存在与否与菌株地理来源没有明显相关性,显示香菇病毒极可能通过担孢子在自然界广泛传播。本研究为开展香菇菌种病毒病快速检测,从源头控制香菇病毒病传播,追踪病毒病的发生流行规律奠定了基础。

关键词：香菇 LeV-HKB病毒 LePVI病毒 rt-pcr检测技术地理分布

中国香菇种质资源真菌病毒分离鉴定与香菇双分体病毒1（LePV1）分子变异研究

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中国香菇种质资源真菌病毒分离鉴定与香菇双分体病毒1（LePV1）分...

作者：王锦杰华中农业大学

学位级别：硕士

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是世界上栽培范围最广的食用菌之一。香菇病毒是香菇生产上较重要的一类潜在隐患。本研究采用dsRNA和rt-pcr检测技术,首次系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中dsRNA/病毒携带情况,并对新发现dsR... 详细信息

香菇(Lentinula edodes(Berk.)Pegler)是世界上栽培范围最广的食用菌之一。香菇病毒是香菇生产上较重要的一类潜在隐患。本研究采用dsRNA和rt-pcr检测技术,首次系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中dsRNA/病毒携带情况,并对新发现dsRNA/病毒进行了克隆和分子特征分析,在此基础上,对其中主要病毒的分子变异和群体结构进行了分析。取得的具体研究结果如下:(1)以215个中国香菇种质资源包括90株栽培菌株和125株野生菌株为试验材料,采用dsRNA检测技术对dsRNA/病毒携带情况进行了调查。研究结果表明,分别在57个栽培菌株和84个野生菌株中检测到dsRNA条带,检测率分别为63.33%(57/90)和67.20%(84/125)。共检测出dsRNA带型有10条,大小分别为12.0kb(dsRNA-1)、10.0 kb(dsRNA-2)、2.4 kb(dsRNA-3)、2.3 kb(dsRNA-4)、2.1 kb(dsRNA-5)、2.0 kb(dsRNA-6)、1.9 kb(dsRNA-7)、1.8 kb(dsRNA-8)、1.6 kb(dsRNA-9)、0.6 kb(dsRNA-10)。进一步对这些条带进行分离与随机克隆,除dsRNA-7外,其他9条dsRNA均获得了其部分或全长基因组序列。序列分析结果表明,dsRNA-1为前人报道的*** mycovirus HKB(LeV-HKB)病毒,dsRNA-2可能是LeV-HKB的一个变种或缺陷型,dsRNA-3和dsRNA-4为*** partitivirus 1(LePV1)病毒,dsRNA-6为一种新发现双分体病毒,dsRNA-5和dsRNA-9为一种新的双节段病毒、dsRNA-7和dsRNA-8为一种新发现双分体病毒。dsRNA-10具体属性仍然未知。这10条dsRNA条带在215个供试菌株中共组成12种带型组合(带型III),其中带型I(仅由ds RNA-1)、带型II(dsRNA-1、dsRNA-3和dsRNA-4)和带型XI(dsRNA-3和dsRNA-4)检测率最高,分别为26.5%(57/215)、16.3%(35/215)、17.7%(38/215),其他带型检测率均低于0.1%。以上结果表明,中国香菇种质资源中LeV-HKB和LePV1为2种主要病毒,以单独或复合感染的方式存在。进一步采用rt-pcr技术对香菇种质资源中这2种主要病毒进行了检测。结果表明,除部分携带有LeV-HKB的菌株和少数携带有LePV1的菌株dsRNA检测和rt-pcr检测结果不一致外,其他菌株用这2种方法检测的结果基本一致。相比较而言,LeV-HKB在栽培菌株中检测率高于野生菌株,而LePV1在野生菌株中检测率要高于栽培菌株。此外,栽培菌株和野生菌株中dsRNA携带情况与菌株地理来源和遗传背景没有明显相关性。(2)以香菇核心种质资源中鉴定携带有LePV1病毒的27个香菇菌株为材料,根据LePV1基因组序列分别设计了能够扩增该病毒dsRNA-3和dsRNA-4的全长基因组引物,对这27个LePV1分离物进行了全基因组克隆与测序。结果表明,dsRNA-3均克隆得到了其全长2380bp的序列,克隆得到的dsRNA-4由于3’端poly(A)尾腺嘌呤数目的差异导致得到的序列存在差异,分别为2225 bp-2231 bp。进一步对这27个LePV1分离物和1个分离于生产上表现异常的香菇菌株SX12的LePV1分离物采用序列分析软件Clustal X 2.0进行了相似性比较,结果表明,这28个LePV1相似性非常高,其中dsRNA-3和dsRNA-4的核苷酸相似性分别为98.84%、98.57%,氨基酸相似性分别为99.61%、99.46%。dsRNA-3和dsRNA-4的核苷酸变异均在基因组上分布不均一,相比较而言,非翻译区较编码区更为保守;这28个分离物之间的变异主要为同义突变,非同义突变较低,RdRp和CP的非同义突变率分别为6.7%和5.3%;来源于SX 12的LePV1分离物与其他27个分离物仅在RdRp上存在1个氨基酸差异。系统进化分析结果表明,这28个菌株聚为2类,其中大部分LePV1分离物与来源于SX12的分离物共24个聚为亚型I,另外4个菌株(EFISAAS0351、YAASM3334、L12、Hunong-1)聚为亚型II,相比较而言,亚型II比亚型I遗传多样性更为丰富。此外,这些分离物的分子聚类结果与地理来源不存在相关性。本项研究为从源头(菌种)上控制香菇病毒病害发生提供重要信息,也为追踪类似病毒病害的发生、流行监控等发面奠定重要理论基础。

关键词：香菇 dsRNA检测技术地理分布 rt-pcr检测技术分子变异