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一株塞内卡病毒A全基因组序列测定与致病性分析

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 820-826页

作者：赖隆永刘小龙谭礼宁叶盛聪邱灵姗陈盛勇刘楚楚徐磊派生特(福州)生物科技有限公司福州350500 福建农业职业技术学院福州350303

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因... 详细信息

本研究旨在明确塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的同源性关系,并了解SVA-FJLY株的致病性。以分离自福建省某养殖场中的一株SVA-FJLY株为研究对象,参照其原型毒株SVV-001(GenBank No.DQ641257.1)全基因组序列设计5对引物,通过RT-PCR扩增、测序、拼接,获得SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析;并通过滴鼻攻毒3~4周龄仔猪。结果表明,SVA-FJLY株基因组全长7275 bp(不包括PolyA),SVA-FJLY株基因组存在一个多聚蛋白、VP1蛋白和VP2蛋白。SVA-FJLY株与参考毒株之间的基因组一级结构有较高的相似性,与HeB01-2017株(MF967574.1)相似性最高,达98.5%;而与SVA原型毒株SVV-001株(DQ641257.1)的相似性较低,为93.9%。SVA-FJLY株与国内几个毒株属于同一个分支,与国内的HeB01-2017株亲缘关系最近,同时与国外Colombia-2016株(KX857728.1)的亲缘关系最近。通过动物试验发现试验组猪攻毒10 d后,试验组2/3发病,对照组3/3正常,未出现仔猪死亡。通过全基因组序列测定获得了SVA-FJLY株全基因组序列并进行序列分析,明确SVA-FJLY株的基因组特性及其与其他毒株的相似性关系,了解了SVA-FJLY株的致病性,为SVA的反向遗传学和疫苗的研制提供参考依据,同时也丰富了SVA的基因组信息数据库。

关键词：塞内卡病毒A RT-PCR扩增序列分析遗传进化树同源性 SVA-FJLY株致病性

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1株塞内卡病毒A型的基因组序列与演化分析

畜牧兽医学报 2021年第2期52卷 553-559页

作者：李宁郭慧芳王白玉乔麒龙黄庆李永涛王增赵军河南农业大学牧医工程学院郑州450046

旨在分析塞内卡病毒A型(Senecavirus A,SVA)CH-HNCY-2019株的基因组特性和演化,参考SVA毒株SVV-001(GenBank No.NC011349)全基因组序列设计8对引物,通过RT-PCR扩增和测序获得SVA CH-HNCY-2019株全基因序列并进行序列分析。结果显示,SVA分离株CH-HNCY-2019基因组全长为7294个核苷酸,与中国分离株核苷酸相似性为95.9%~99%,与美国经典株SVV-001核苷酸相似性最低。CH-HNCY-2019与大多数中国2017—2018年分离毒株亲缘关系较近,处于同一分支,而与中国2015—2016年分离株亲缘关系较远。与包括2019年中国广东4个SVA分离株在内的其他国内外分离株相比,CH-HNCY-2019的VP1蛋白的722位氨基酸由L突变为Q;VP3蛋白的499位氨基酸由A突变为V,528位氨基酸由P突变为S,582位氨基酸由E突变为K。本研究成功获得1株SVA CH-HNCY-2019全基因组序列,研究结果提示,SVA中国流行株具有多样性,而且在不断地演变,应加强SVA的分子流行病学调查、生物安全措施和疫苗研发以防止SVA在我国猪群中的广泛传播。

关键词：塞内卡病毒A RT-PCR扩增 SVA CH-HNCY-2019 基因组序列分析遗传进化

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猪胚胎成纤维细胞αGal表达的鉴定

中华器官移植杂志 2005年第9期26卷 521-523页

作者：王坤庄国华张同琳林爱星周孝思北京大学第三医院器官移植中心 100083 中国农业大学农业生物技术国家重点实验室

目的确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷,为下一步进行基因工程改造的结果提供鉴定方法。方法采用逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和Western免疫印迹法分别在转录和翻译水平确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷。结果通过rt-... 详细信息

目的确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷,为下一步进行基因工程改造的结果提供鉴定方法。方法采用逆转录聚合酶链反应(rt-pcr)和Western免疫印迹法分别在转录和翻译水平确定猪胚胎成纤维细胞是否合成α1,3半乳糖苷。结果通过RT-PCR扩增,发现α1,3半乳糖苷转移酶基因在原代和传代培养的猪胚胎成纤维细胞内转录,Western免疫印迹证实,在原代和传代培养的猪胚胎成纤维细胞能合成含有α1,3半乳糖苷残基的糖蛋白。结论猪胚胎成纤维细胞可合成α1,3半乳糖苷;可采用pcr扩增和Western免疫印迹方法对经过基因工程改造的猪胚胎成纤维细胞是否表达α1,3半乳糖苷转移酶进行鉴定。

关键词：猪胚胎成纤维细胞半乳糖转移酶类鉴定方法猪胚胎 Western免疫印迹方法逆转录聚合酶链反应 RT-PCR扩增 Gal

荧光定量聚合酶链反应检测基质金属蛋白酶组织抑制因子-1方法的建立

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中华检验医学杂志 2005年第5期28卷 533-537页

作者：丛敏阎钟钰王萍张岩徐雍卢炎王宝恩贾继东尤红首都医科大学附属北京友谊医院肝病中心 100050

目的构建含有金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(pcr)技术检测TIMP-1的标准曲线,为荧光定量pcr准确检测TIMP-1奠定基础.方法提取大鼠星状细胞系HSC-T6的mRNA,经RT-PCR扩增TIMP-1基因后与... 详细信息

目的构建含有金属蛋白酶组织抑制因子-1(TIMP-1)的重组质粒并以其为模板建立荧光定量聚合酶链反应(pcr)技术检测TIMP-1的标准曲线,为荧光定量pcr准确检测TIMP-1奠定基础.方法提取大鼠星状细胞系HSC-T6的mRNA,经RT-PCR扩增TIMP-1基因后与pGMT-Vector 连接,转化到大肠杆菌DH5α,以筛选得到的阳性克隆质粒作为标准品进行梯度稀释,分别用Taqman荧光探针技术和SYBR Green I荧光染料技术进行荧光定量pcr检测,建立标准曲线,并对两者结果进行了对比.同时进行普通pcr检测,与荧光定量pcr方法检测结果进行比较.结果重组质粒经pcr扩增及序列测定,表明pGMT-TIMP-1基因已成功克隆.以不同稀释水平的标准品质粒进行荧光定量pcr扩增, 应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线的线性检测范围为7×104～7×108拷贝,检测灵敏度为7×104拷贝;应用SYBR Green I荧光染料技术的线性检测范围为7×106～7×108拷贝,检测灵敏度为7×106拷贝,且熔解曲线显示出现非特异性扩增;两种技术相对于普通pcr技术均具有定量功能.结论所构建的pGMT-TIMP-1基因荧光定量pcr检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好, 灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为荧光定量pcr检测TIMP-1基因的标准方法.

关键词：基质金属蛋白酶组织抑制因子-1 荧光定量聚合酶链反应检测 Taqman荧光探针技术荧光定量pcr检测 TIMP-1基因聚合酶链反应(pcr) 荧光定量pcr方法 RT-PCR扩增 Green 检测灵敏度标准曲线 HSC-T6 重组质粒 SYBR 荧光染料

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猪繁殖与呼吸综合征病毒ZB株的分离与鉴定

黑龙江畜牧兽医 2015年第9期 171-173,176,295页

作者：孟日增刘金华孟庆峰石建平王伟利吴连鹏吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心长春130062

为了确定从高度疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的猪内脏中分离得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的类型,试验进行了形态学观察、血清学分析、免疫学分析、RT-PCR扩增等一系列鉴定分析。结果表明:从疑似病料中分离获得的病毒可以使... 详细信息

为了确定从高度疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的猪内脏中分离得到的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)毒株的类型,试验进行了形态学观察、血清学分析、免疫学分析、RT-PCR扩增等一系列鉴定分析。结果表明:从疑似病料中分离获得的病毒可以使Marc-145细胞产生明显病变,而在Vero和PK-15细胞上不出现细胞病变,从而确定试验获得的病毒为PRRSV,命名为ZB株。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 形态学观察血清学分析免疫学分析 RT-PCR扩增

一种含多拷贝CpG基序的质粒构建及其对水产动物的免疫调节作用

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一种含多拷贝CpG基序的质粒构建及其对水产动物的免疫调节作用

作者：陈颖浙江大学

学位级别：硕士

CpG ODN是一类以CpG为核心的具有免疫激活功能的寡核苷酸序列。它能直接或间接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞、T细胞、NK细胞的活化或增殖,诱导以Th1型为主的免疫应答,是一种高效低毒的免疫激活剂。但人工合成的CpG OD... 详细信息

CpG ODN是一类以CpG为核心的具有免疫激活功能的寡核苷酸序列。它能直接或间接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞、T细胞、NK细胞的活化或增殖,诱导以Th1型为主的免疫应答,是一种高效低毒的免疫激活剂。但人工合成的CpG ODN成本高、产量低,不适用于大规模生产,限制了CpG免疫刺激剂在水产养殖中的普遍应用。利用ODNs的核酸分子特征,插入质粒载体,通过工程菌株的自身繁殖大量扩增免疫刺激序列将有效解决成本昂贵,生产率低的问题,有助于新型水产抗病药物的研制开发。实验的第一章,我们选择对鱼虾类有较佳免疫活性的CpG ODNs,相互串联并人工合成,利用同尾酶切技术将串联序列五次重复克隆于pYES2载体中,构建成含多拷贝CpG基序（90个拷贝）的质粒载体pYES2-90CpG。实验的第二章,分别以鲫鱼（Carassius auratus）,鲈鱼（Lateolabrax japonicus）两种重要经济养殖鱼类为实验材料,评价携带多拷贝CpG基序的质粒DNA在鱼类中的免疫活性,尤其是非特异性免疫刺激和调节作用。结果显示:pYES2-90CpG能体外诱导鲫鱼、鲈鱼头肾的巨噬细胞活化,引发呼吸爆发作用和杀菌活性;直接促进外周血淋巴细胞的增殖,免疫刺激效应均明显高于空质粒产生的作用。另外,鲫鱼经pYES2-90CpG注射后48h,体内诱导头肾细胞Mx蛋白（一种Ⅰ型IFN诱生蛋白）的表达,刺激天然杀伤细胞增强因子（NKEF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和MHCⅡβ等免疫相关分子基因表达量的增加。这些发现提示,CpG DNA可以作为进一步理解鱼类是如何抵抗病原细菌侵染的重要工具。实验的第三章,pYES2-90CpG腹腔注射南美白对虾（Litopenaeus vannamei）12h后,以空质粒为阴性对照,使血清的酚氧化酶（PO）和溶菌酶（LSZ）活力显著提高,血清抗菌力水平增强。说明CpG ODNs串联序列能有效激活养殖对虾的非特异免疫力。由此可见,含多拷贝CpG基序的质粒pYES2-90CpG有效增强水产动物细胞和体液介导的免疫应答,有望成为高活性、低成本的广谱型CpG免疫增强剂,用于提高鱼虾等养殖水产类的免疫水平,在减少水产类病害和增强鱼用疫苗的免疫效力方面有着广泛的应用前景。

关键词： CpG基序质粒鲫鱼鲈鱼南美白对虾免疫激活巨噬细胞 O2- 杀菌力外周血淋巴细胞增殖 RT-PCR扩增血清溶菌酶酚氧化酶抗菌活力

同方学位论文库评论

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AIF重组质粒的构建、表达和功能的研究

毒理学杂志 2005年第3期19卷 202-204页

作者：袁长青丁振华马树东凌朝辉刘胜军胡贵方郑莉周美娟欧程山第一军医大学热带军队卫生学系放射医学教研室广东广州510515 上海转基因研究中心

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,rtpcr扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1(+)... 详细信息

目的构建人凋亡诱导因子(AIF)基因功能片段的真核表达载体pcDNA3.1(+)AIF,并初步研究AIF在细胞凋亡中的作用。方法从人细胞中提取总RNA,rtpcr扩增AIF基因片段;克隆到pMD18T载体上,通过酶切和测序进行鉴定;将AIF基因片段插入pcDNA3.1(+),构建真核表达载体;电转化淋巴母细胞Raji细胞,观察AIF的表达水平和功能。结果成熟AIF蛋白分子在真核细胞中表达,并转移到细胞核中,诱导Caspase非依赖性细胞凋亡。结论成功构建了pcDNA3.1(+)AIF真核表达载体,AIF在Caspase非依赖性细胞凋亡中发挥重要作用。

关键词：凋亡诱导因子真核表达载体构建 AIF pcDNA3.1(+) Caspase非依赖性重组质粒 RT-PCR扩增细胞凋亡基因片段

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猪NPY受体Y1 cDNA的克隆及分析

安徽农业科学 2008年第36期36卷 15797-15798页

作者：周春宝倪黎纲丁家桐包文斌江苏畜牧兽医职业技术学院江苏泰州225300 江苏姜曲海种猪场江苏泰州225300 扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009

[目的]研究猪NPY-Y1受体在猪激素分泌及发育生理功能中的调节作用。[方法]从初情期的苏姜猪母猪中提取下丘脑组织总RNA,RT-PCR扩增出NPY-Y1 cDNA,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。[结果]试验扩增产物与GeneBank公布的猪NP... 详细信息

[目的]研究猪NPY-Y1受体在猪激素分泌及发育生理功能中的调节作用。[方法]从初情期的苏姜猪母猪中提取下丘脑组织总RNA,RT-PCR扩增出NPY-Y1 cDNA,扩增产物克隆入pGEM-T easy载体中进行序列测定。[结果]试验扩增产物与GeneBank公布的猪NPY-Y1序列比较,其同源性达到100%。[结论]为下一步研究猪NPY-Y1基因的生理功能和作用机理奠定了基础。

关键词：苏姜猪 NPY-Y1基因 RT-PCR扩增序列分析

ClassⅡ基因型Ⅶd亚型强毒引起鸡新城疫的诊断

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中国家禽 2011年第17期33卷 53-54页

作者：潘金金邹晓艳赵国陈素娟扬州大学兽医学院江苏扬州225009

2010年2月江苏省大丰市某农户散养的草鸡发病,病鸡主要表现为精神萎顿,食欲减退,呼吸困难,运动失调,排黄白色粪便,经临床和实验室诊断确诊为新城疫（ND）。将分离到的新城疫病毒（NDV）通过RT-PCR扩增F基因后测序及绘制系统发生树分析... 详细信息

2010年2月江苏省大丰市某农户散养的草鸡发病,病鸡主要表现为精神萎顿,食欲减退,呼吸困难,运动失调,排黄白色粪便,经临床和实验室诊断确诊为新城疫（ND）。将分离到的新城疫病毒（NDV）通过RT-PCR扩增F基因后测序及绘制系统发生树分析，表明该鸡群感染的新城疫病毒为ClassⅡ基因型的Ⅶd亚型强毒。诊断情况如下：

关键词：实验室诊断 Class 鸡新城疫基因型强毒亚型 RT-PCR扩增新城疫病毒