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rspo3在乳腺癌中的表达及其在体外对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

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RSPO3在乳腺癌中的表达及其在体外对乳腺癌细胞增殖和转移的影响

作者：蒋树云青海大学

学位级别：硕士

目的:初步探讨rspo3在乳腺癌患者中的表达情况,分析其表达水平与患者临床病理特征之间的相关性,体外进一步研究异常表达的rspo3对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响并探讨相关的调控机制,为乳腺癌的精准治疗提供更多的实验依据。方法:一... 详细信息

目的:初步探讨rspo3在乳腺癌患者中的表达情况,分析其表达水平与患者临床病理特征之间的相关性,体外进一步研究异常表达的rspo3对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响并探讨相关的调控机制,为乳腺癌的精准治疗提供更多的实验依据。方法:一、生物信息学肿瘤公共数据库(如TIMER2.0、HPA、TCGA等)分析rspo3在乳腺癌组织和癌旁组织中的差异表达及其与患者病理学特征之间的相关性;Kaplan-Meier Plotter绘制rspo3的表达水平与乳腺癌患者的预后生存曲线;GO和KEGG基因功能富集分析和代谢通路分析;TIMER2.0检测rspo3表达水平和肿瘤微环境免疫细胞浸润相关性;String数据库构建PPI网络;二、收集40例符合纳排标准的乳腺癌患者的乳腺癌组织及其对应的癌旁组织标本,逆转录及实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)方法检测以上组织标本中rspo3的表达水平,通过Spearman相关性分析,对rspo3表达水平和乳腺癌患者的临床病理特征进行相关性分析;三、运用慢病毒转染技术在人乳腺癌细胞株HCC1937中过表达rspo3,后采用CCK-8法、Transwell、q RT-PCR、免疫蛋白印迹实验(Western blot)等方法分别观察过表达rspo3对乳腺癌细胞HCC1937增殖和转移能力的影响,并进一步探讨其相关的分子学机制。结果:一、生物信息学分析结果:1、rspo3在乳腺癌组织中呈低表达;2、rspo3在乳腺癌中的表达水平与乳腺癌患者的年龄、肿瘤直径以及分子分型相关;3、乳腺癌中低表达的rspo3与患者的预后不良相关;4、rspo3相互作用的基因主要富集于免疫细胞及其受体等参与的生物学过程;5、免疫细胞浸润分析结果提示,rspo3在乳腺癌中的表达与巨噬细胞(macrophages)、CD4+记忆T细胞(CD4+T cell memory)、CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞等的浸润水平呈正相关,而与调节性T细胞(Treg细胞)的浸润水平呈负相关;6、KEGG代谢通路分析提示rspo3可能参与Wnt/β-catenin通路调控乳腺癌的进展。二、组织学实验结果:1、rspo3在乳腺癌组织中的表达较癌旁组织显著降低;2、rspo3在乳腺癌的表达与乳腺癌患者的病理组织分级、TNM分期相关。三、细胞学实验结果:1、rspo3在人乳腺癌细胞株MCF-7、MD-MBA-231、BT-474、HCC1937中的表达显著降低;2、CCK-8实验结果提示,过表达rspo3可抑制HCC1937细胞的增殖能力;3、Transwell实验结果提示过表达rspo3可显著降低HCC1937细胞的侵袭及迁移能力;4、过表达rspo3可能通过抑制β-catenin通路而调控HCC1937细胞的增殖和转移能力。结论:1、rspo3在乳腺癌组织中表达降低且其表达水平与患者的病理组织学分级、TNM分期相关;2、体外功能学实验表明rspo3过表达可抑制HCC1937细胞的增殖和转移能力,提示其在乳腺癌的进展中可能发挥抑癌功能;3、乳腺癌中低表达的rspo3可能导致患者预后不良,其可能通过调控乳腺癌肿瘤微环境中免疫细胞的浸润水平以及参与激活β-catenin通路而调控乳腺癌的进展。

关键词：乳腺癌 rspo3 增殖转移 β-catenin

基于生物信息学分析乳腺癌组织中rspo3基因甲基化水平及临床意义

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现代肿瘤医学 2021年第22期29卷 3933-3937页

作者：赵保双付雪飞华堃池范慧生刘新宇杨梦张诗剑刘阳杜博松王新超天津市第四中心医院甲状腺乳腺外科天津300000 天津医科大学研究生院天津300000

目的:讨论rspo3基因在乳腺癌组织中的表达情况,启动子甲基化水平及意义。方法:通过The Human Protein Atlas分析rspo3蛋白在乳腺癌组织中的表达情况;利用Oncomine、GEPIA、UALCAN数据库分析rspo3 DNA、mRNA在乳腺癌组织中的表达情况;利... 详细信息

目的:讨论rspo3基因在乳腺癌组织中的表达情况,启动子甲基化水平及意义。方法:通过The Human Protein Atlas分析rspo3蛋白在乳腺癌组织中的表达情况;利用Oncomine、GEPIA、UALCAN数据库分析rspo3 DNA、mRNA在乳腺癌组织中的表达情况;利用MethHC和UALCAN数据库分析rspo3基因启动子区域甲基化水平;利用String-DB分析与rspo3相互作用的蛋白。结果:在蛋白水平上,rspo3蛋白在乳腺癌组织中较正常乳腺组织低表达,在DNA、mRNA水平上,rspo3在乳腺癌组织中较正常乳腺组织显著低表达,且其启动子甲基化水平则显著增高。与rspo3相关蛋白有LGR(4~6)、UBA52、UBB、UBC、rspo1、rspo4、ZNRF3、RNF43,可能调节乳腺癌中Wnt/β-catenin信号传导通路的激活。结论:基于现有的肿瘤数据库进行生物信息学分析,可以发现rspo3在乳腺癌组织中呈低表达,其启动子甲基化水平则表达增高。这为深入研究乳腺癌,并发现新的乳腺肿瘤标志物提供了大样本数据支持。

关键词：乳腺癌 rspo3 甲基化

斑马鱼rspo3基因对Wnt通路负调控机理的初步研究

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斑马鱼Rspo3基因对Wnt通路负调控机理的初步研究

作者：周玭中国海洋大学

学位级别：硕士

Wnt信号通路是生物体中最重要的信号通路之一,其在生物体中控制细胞的增值、分化以及形态发生。R-spondin(rspo)家族是一个近年来新发现的蛋白家族,由4个分泌性蛋白(rspo1-4)组成。研究报道rspo蛋白在脊椎动物的发育过程中发挥重要的作... 详细信息

Wnt信号通路是生物体中最重要的信号通路之一,其在生物体中控制细胞的增值、分化以及形态发生。R-spondin(rspo)家族是一个近年来新发现的蛋白家族,由4个分泌性蛋白(rspo1-4)组成。研究报道rspo蛋白在脊椎动物的发育过程中发挥重要的作用。其作用与经典Wnt信号通路的配体相似,都是通过激活β-catenin发挥其生物学活性。目前关于硬骨鱼类rspo蛋白结构与功能的报道很少。因此本研究以斑马鱼为模型,对rspo3对Wnt通路的调控作用及其在斑马鱼发育过程中的功能进行了初步的研究。我们通过荧光素酶报告基因检测,发现rspo3在斑马鱼体内可以拮抗由外源Wnt3a配体诱导的Wnt通路的激活,也可以抑制内源的Wnt通路;同时也可以拮抗外源Wnt3a配体诱导的Wnt通路直接靶基因boz、sp5l的表达。而斑马鱼rspo3的敲降则可以激活Wnt通路,造成胚胎头部减小,眼部减小。另外我们通过结构域删除突变体的显微注射实验发现,rspo3的Fu结构域对Wnt通路的负调控至关重要。最有意思的是,与以往对其他物种的研究报道不同,斑马鱼rspo3并不是通过作用于LRP6的胞外结构来实现对Wnt通路的调控的,而是通过作用于胞内的β-catenin蛋白或β-catenin上游的信号传导因子抑或是其他膜受体来抑制Wnt通路的。至此我们发现了斑马鱼与其他脊椎动物所不同的rspo3蛋白对Wnt通路的作用方式。斑马鱼作为一种新兴的模式生物,其在基因和蛋白质的结构与功能上都表现出很高的保守性,在研究脊椎动物的生长发育、人类疾病模型的构建等方面有着重大的意义,而发现其与其他脊椎动物在信号传导方面的一些差异,将会帮助我们更迅速、更准确、更深入的将其与高等生物的生长发育相结合,为研究高等生物的生长发育提供准确有效的遗传学工具。

关键词： rspo3 斑马鱼敲降发育 Wnt信号通路

Gαi蛋白介导rspo3诱导的Akt-mTOR信号转导及促血管生成作用

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Gαi蛋白介导RSPO3诱导的Akt-mTOR信号转导及促血管生成作用

作者：齐丽娜苏州大学

学位级别：硕士

研究目的:R-spondin3(rspo3)在血管发育和血管生成中发挥重要作用。近期研究证实rspo3可激活Akt-mTOR通路,但具体分子机制有待明确。已知G蛋白抑制性α亚单位(Gαi蛋白)在生长因子刺激下作为关键信号蛋白介导下游Akt-mTOR等通路活化。... 详细信息

研究目的:R-spondin3(rspo3)在血管发育和血管生成中发挥重要作用。近期研究证实rspo3可激活Akt-mTOR通路,但具体分子机制有待明确。已知G蛋白抑制性α亚单位(Gαi蛋白)在生长因子刺激下作为关键信号蛋白介导下游Akt-mTOR等通路活化。本论文关注了 Gαi1和Gαi3蛋白在rspo3信号及促血管生成中的作用。研究方法:多个基因手段(shRNA、CRISPR/Cas9、显性负性遗传、过表达等)正向或负向调节小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)内Gαi1/3蛋白的表达/活化水平,检测rspo3诱导的Akt-mTOR信号通路以及接头蛋白Gab 1活化。在Gαi1/3敲减的内皮细胞(HUVECs和HCMEC/D3)中,使用Transwell、Matrigel(基质胶)Transwell、EdU(2'-脱氧-5-乙炔尿苷)实验和成管实验等方法检测Gαi1/3在rspo3介导的血管生成中的作用。运用玻璃体腔内注射带Tie1启动子慢病毒载体,观察内皮细胞特异性敲减Gαi1/3后对rspo3促视网膜血管生成的作用。研究结果:小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中,Gαi1和Gαi3双敲除(DKO)阻断了 rspo3诱导的Akt-mTOR信号通路活化;通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除Gαi1和Gαi3的表达同样显著抑制了 rspo3诱导的Akt-mTOR的活化;Gαi1或Gαi3单敲除部分抑制rspo3诱导的Akt-mTOR信号活化;而Gαi2单敲除对rspo3诱导的Akt-mTOR信号活化无显著影响;shRNA敲减Gαi1/3或利用显性负性遗传使Gαi1/3突变抑制rspo3诱导的Akt-mTOR的活化;在Gαi1/3双敲除的MEFs中外源性的导入Gαi1或Gαi3,部分拯救rspo3诱导的Akt-mTOR的活化;Gαi1/3的过表达增强了 rspo3诱导的Akt-mTOR的活化。rspo3处理后,Gαi1/3介导的Akt通路活化独立于Wnt/β-catenin信号,但需要适配体蛋白Gab1。在HUVEC和HCMEC/D3血管内皮细胞中,Gαi1/3的敲减抑制了rspo3诱导的Akt-mTOR信号活化及细胞迁移、侵袭、增殖和体外成管。导入持续活化的Akt1质粒挽救Gαi1/3敲减细胞中rspo3体外促血管作用。在体实验表明内皮细胞特异性敲减Gαi1/3后显著抑制rspo3过表达诱导的小鼠的视网膜血管生成。研究结论:Gαi1/3是rspo3介导的下游Akt-mTOR信号活化的关键信号蛋白。Gαi1/3参与rspo3诱导的血管内皮细胞增殖、迁移、侵袭和成管。内皮细胞特异性敲减Gαi1/3抑制rspo3过表达诱导的小鼠的视网膜血管生成。

关键词： Gαi rspo3 Akt-mTOR 信号转导

FOXP3转录调控rspo3在非小细胞肺癌放射抵抗中的作用机制

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FOXP3转录调控RSPO3在非小细胞肺癌放射抵抗中的作用机制

作者：何致民兰州理工大学

学位级别：硕士

肺癌是我国最常见、死因居第一位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80%～85%。放射治疗是NSCLC综合治疗中不可或缺的部分,然而在临床治疗中,部分患者会出现放射抵抗现象,导致肺癌的局部复发甚至整个放疗的失败。因此,探... 详细信息

肺癌是我国最常见、死因居第一位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(NSCLC)占所有肺癌病例的80%～85%。放射治疗是NSCLC综合治疗中不可或缺的部分,然而在临床治疗中,部分患者会出现放射抵抗现象,导致肺癌的局部复发甚至整个放疗的失败。因此,探索NSCLC放射抵抗机制,提高肺癌的放疗敏感性,对于肺癌的临床治疗将产生重要影响。本课题组前期建立了X射线抵抗肺癌细胞株,通过转录组测序筛选差异表达基因,共鉴定到上调基因207个,下调基因137个。其中,rspos家族成员之一的rspo3在X射线抗性株中显著下调,引起了我们的研究关注。rspos家族成员有着相似的结构,广泛参与调控多种生物学功能,包括血管新生,骨骼增长,生殖系统、呼吸系统和消化系统的发育等。此外,研究发现rspo3可以通过Wnt/β-catenin信号通路参与包括肺癌在内的多种恶性肿瘤的发生。而Wnt通路能够通过调节细胞周期,DNA损伤修复,细胞凋亡等过程参与细胞辐射抗性的调节。目前,对rspo3参与调控细胞辐射抗性的机制仍知之甚少。前期研究已经证实rspo3在X射线射抗性肺癌细胞株中表达下调,为了探究其异常表达的分子机制,我们从转录水平分析了其调控机制。首先利用生物信息学手段,预测了可以调控rspo3的上游转录因子,然后通过表达相关性、q-PCR及双荧光素酶报告基因实验验证,确认转录因子FOXP3能够调节rspo3的表达。FOXP3是转录因子叉头蛋白家族的一员,是调节性T细胞(Treg)发育和功能的主要调节因子。FOXP3的异常表达可能会导致人体的自身免疫疾病。FOXP3在多种恶性肿瘤中均有表达,但表达情况及功能作用各有不同。FOXP3在不同的肿瘤中分别扮演着促癌和抑癌两种截然不同的角色。作为转录因子,FOXP3对肿瘤发生的调控作用研究日益深入,而对于肿瘤细胞的放射抵抗机制研究较少。本文以rspo3与NSCLC的放射抵抗为出发点,探索其上游的转录调控机制,并对所预测的转录因子FOXP3与NSCLC的放射抵抗相关机制展开研究,为NSCLC的放射治疗提供一定的理论依据。本论文主要研究结果如下:(1)利用生物信息学手段分析rspo3上游转录调控机制;分析了候选转录因子的生物学功能及临床相关性;(2)mRNA水平及蛋白水平验证了FOXP3与rspo3的表达相关性,根据预测的结合位点,设计位点突变,通过双荧光素酶报告基因实验验证了FOXP3与rspo3的转录调控关系及结合位点;(3)细胞功能学实验验证了FOXP3通过rspo3参与调控NSCLC辐射抗性。

关键词：放疗放射抵抗非小细胞肺癌 FOXP3 rspo3 转录因子

斑马鱼rspo3基因的克隆、表达及初步功能研究

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斑马鱼Rspo3基因的克隆、表达及初步功能研究

作者：陈晨中国海洋大学

学位级别：硕士

Wnt信号通路是生物体内最重要的信号传导途径之一。Wnt信号通路在胚胎和成体中控制细胞的增殖、分化以及形态发生。R-spondin（rspo）是一个近年来新发现的蛋白家族，由4个分泌型蛋白组成（rspo1-4）。研究报道rspo蛋白在脊椎动物的发... 详细信息

Wnt信号通路是生物体内最重要的信号传导途径之一。Wnt信号通路在胚胎和成体中控制细胞的增殖、分化以及形态发生。R-spondin（rspo）是一个近年来新发现的蛋白家族，由4个分泌型蛋白组成（rspo1-4）。研究报道rspo蛋白在脊椎动物的发育过程中发挥重要作用。rspo蛋白的作用与经典Wnt信号通路的配体类似，都是通过激活β-catenin发挥其生物学活性。目前鲜有关于硬骨鱼rspo蛋白结构与功能的报道。因此本研究克隆了斑马鱼rspo3，并对其结构与功能进行了初步研究。通过分析斑马鱼rspo3的蛋白结构发现，与现已报道的rspo包含2个furin-like结构域的蛋白结构不同，斑马鱼rspo3蛋白包含3个furin-like结构域。为确定这种特殊的蛋白结构是否在硬骨鱼rspo基因中普遍存在，本研究预测得到青鳉、河豚和三棘刺鱼的rspo3，并且发现这三种硬骨鱼的rspo3同样具有3个furin-like结构域。rspo3mRNA在斑马鱼早期胚胎发育的各个时期都有表达。在12hpf （hours post fertilization）之前随着胚胎的发育，rspo3表达量逐渐升高;12hpf之后维持在相对稳定的较高表达水平。原位杂交结果显示rspo3mRNA在多个组织中表达，在神经系统以及骨组织中表达水平较高。在斑马鱼胚胎中过表达rspo3mRNA导致胚胎严重畸形，包括头部增大、躯干缩短、尾部卷曲等。过表达rspo3导致的神经胚层前部化、背部神经系统发育异常以及抑制胚胎后部结构的发育等表型类似于之前报道的敲降了Wnt3a和/或Wnt8的胚胎表型，还与过表达了dkk1和Frzb的胚胎表型一致。将rspo3mRNA分别与Wnt3a、Wnt8.1mRNA共注射后发现，rspo3的过表达可以挽救由Wnt3a或Wnt8.1过表达引起的A/P轴增长的表型，表明rspo3可以抑制经典Wnt信号通路。将rspo3mRNA与dkk1mRNA共注射，发现共注射rspo3与dkk1可以促进dkk1过表达引起的背部化表型（头部增大、A/P轴变短等）。以上研究结果表明，鱼类的rspo3基因具有独特的蛋白结构，可能通过调节Wnt/β-catenin信号通路发挥其复杂的生物学功能。

关键词： rspo3 斑马鱼硬骨鱼发育 Wnt

rspo3参与新生内膜形成及调节血管平滑肌细胞功能的实验研究

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中国心血管病研究 2022年第7期20卷 637-642页

作者：渠航陈冲罗雪阳丁晓维上海交通大学医学院附属新华医院心血管发育与再生医学研究所上海市200082

目的探究rspo3是否参与小鼠血管损伤后新生内膜形成以及对平滑肌细胞功能的调控作用。方法本实验于2021年5月至2022年2月在新华医院发育与再生医学研究所完成。构建小鼠股动脉导丝损伤模型,检测股动脉rspo3的表达;在血小板衍生生长因子-... 详细信息

目的探究rspo3是否参与小鼠血管损伤后新生内膜形成以及对平滑肌细胞功能的调控作用。方法本实验于2021年5月至2022年2月在新华医院发育与再生医学研究所完成。构建小鼠股动脉导丝损伤模型,检测股动脉rspo3的表达;在血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)诱导人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)增殖及迁移的细胞模型中检测rspo3的表达,观察小干扰RNA敲低rspo3后PDGF-BB对HASMCs作用的变化。结果小鼠股动脉损伤后rspo3表达升高,且主要集中表达在新生内膜区域;PDGF-BB处理HASMCs后rspo3时间依赖性表达升高,敲低rspo3抑制PDGF-BB诱导的HASMCs增殖和迁移。结论rspo3参与小鼠新生内膜形成的过程,促进PDGF-BB诱导的HASMCs增殖及迁移。

关键词： rspo3 新生内膜形成 PDGF-BB 血管平滑肌细胞

紫苏醇对结肠癌SW480细胞凋亡的影响及其机制研究

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肿瘤药学 2019年第3期9卷 395-399页

作者：任建峰张其胜王慧同济大学附属第四人民医院

目的研究紫苏醇对结肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养结肠癌SW480细胞,分为不同浓度(1μg·mL^-1、5μg·mL^-1、10μg·mL^-1)阿帕替尼组和不同浓度(1μg·mL^-1、5μg·mL^-1、10μg·mL^-1)紫苏醇组,检测各组细... 详细信息

目的研究紫苏醇对结肠癌SW480细胞凋亡的影响及其可能机制。方法体外培养结肠癌SW480细胞,分为不同浓度(1μg·mL^-1、5μg·mL^-1、10μg·mL^-1)阿帕替尼组和不同浓度(1μg·mL^-1、5μg·mL^-1、10μg·mL^-1)紫苏醇组,检测各组细胞内rspo3和Notch-1蛋白的表达、细胞增殖活性、细胞周期、细胞侵袭、转移能力以及凋亡蛋白Caspase-3的活性。结果紫苏醇和阿帕替尼均可抑制结肠癌SW480细胞内rspo3和Notch-1蛋白的表达,并随着浓度升高,抑制作用呈增强趋势(Prspo3和Notch-1蛋白表达的抑制作用显著优于相同剂量的阿帕替尼(P0.05)。低剂量(1μg·mL^-1)紫苏醇和阿帕替尼对Caspase3活性无明显影响(P>0.05),而中、高剂量(5μg·mL^-1、10μg·mL^-1)紫苏醇和阿帕替尼可显著增强结肠癌SW480细胞中Caspase-3的活性(Prspo3基因与蛋白的表达。

关键词： rspo3 结肠癌SW480细胞 Notch信号通路 Caspase3 紫苏醇