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RHDV RdRp基因的克隆分析及其蛋白功能初步研究

RHDV RdRp基因的克隆分析及其蛋白功能初步研究

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作者：庞雪晴四川农业大学

学位级别：硕士

兔病毒性出血症(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)又称兔瘟,是由杯状病毒科兔病毒属兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起的一种急性、高度传染性疾病。RNA依赖性RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)是RHDV一种重要的非结构蛋白,除发挥复制酶的活性外,还具有一些其他功能。为进一步了解RHDV RdRp的生物学功能,在对GI.1型和GI.2型RHDV RdRp进行克隆分析的基础上,通过构建GI.1型RHDV RdRp基因真核表达质粒,在rs-17细胞中检测了RdRp对不同型RHDV病毒RNA转录表达情况的影响。主要内容如下:1.通过PCR、连接转化和测序,分别克隆两株GI.1型(SCH04株)和GI.2型(SCCN03株)RHDV RdRp基因进行比对和生物信息学分析,结果显示两株病毒RdRp基因序列全长均为1548 bp,编码516个氨基酸,核苷酸序列相似性为84.95%,氨基酸序列相似性为96.71%,其编码蛋白存在17个氨基酸差异位点,二者三级结构无明显差异,SCCN03株RdRp比SCH04株多4个磷酸化位点和1个N-糖基化位点。2.通过酶切、连接转化和测序克隆SCH04株RdRp基因,并构建原核表达质粒p ET-32a-RdRp。经IPTG诱导、镍柱亲和层析、Western blot和动物实验,进行RHDV RdRp重组蛋白的表达和及其抗血清制备。结果显示,RdRp重组蛋白大小为75.7 k Da,制备血清ELISA效价达1:512,000。为后续构建的表达RdRp蛋白细胞株的血清学检测提供试验材料。3.通过PCR、纯化回收、连接转化、酶切和测序鉴定,构建真核表达质粒p EGFP-N1-RdRp,转染至兔脾脏成纤维细胞—rs-17细胞系,经G418筛选、RT-PCR、Western blot和间接免疫荧光检测(IFA)等鉴定,成功构建rs-17-RdRp细胞株。将SCH04株与SCCN03株病毒RNA分别转染至rs-17-RdRp和普通rs-17细胞中,在不同时间点收集细胞进行q PCR和IFA分析。结果显示,在rs-17-RdRp细胞中SCH04株主要衣壳蛋白VP60的基因拷贝数显著增加,在转染24 h后上调了170倍;而SCCN03株RNA仅在转染6 h后,其VP60基因拷贝数轻微上调。IFA结果显示,在病毒RNA转染24 h后,SCH04株主要衣壳蛋白VP60在rs-17-RdRp细胞中的表达量比在普通rs-17细胞中的表达量更高,而SCCN03株VP60蛋白的表达量在两种细胞中的变化不明显,与q PCR的结果相符。综上,在RHDV RdRp基因克隆分析的基础上,进行在rs-17细胞中RdRp对RHDV基因组转录表达的影响研究,结果表明,GI.1型RHDV(SCH04株)RdRp能够显著促进其RHDV基因组的复制,而对GI.2型RHDV(SCCN03株)的作用不明显,提示受试RHDV株RdRp遗传虽然相对稳定,但是其功能可能存在不同型的特异性,GI.1型和GI.2型RHDV RdRp的功能是否都存在型特异性还有待进一步研究验证。本研究为人们深入认识RHDV RdRp的生物学活性和RHDV遗传演变提供了科学参考。

关键词：兔病毒性出血症 RdRp 序列分析多克隆抗体 rs-17

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