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The overexpression of rps14 in Lgr5+progenitor cells promotes hair cell regeneration in the postnatal mouse cochlea

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再生工程(英文) 2023年第3期4卷 328-336页

作者： Jingru Ai Pei Jiang Jingyuan Huang Hairong Xiao Yanqin Lin Mingchen Dai Yintao Wang Yuan Zhang Mengyao Tian Renjie Chai Shasha Zhang State Key Laboratory of Digital Medical Engineering Department of Otolaryngology Head and Neck SurgeryZhongda HospitalSchool of Life Sciences and TechnologyAdvanced Institute for Life and HealthJiangsu Province High-Tech Key Laboratory for Bio-Medical ResearchSoutheast UniversityNanjing 210096China Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical SchoolJiangsu Provincial Key Medical Discipline(Laboratory)NanjingChina Research Institute of Otolaryngology NanjingChina Co-Innovation Center of Neuroregeneration Nantong UniversityNantong 226001China Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery Sichuan Provincial People’s HospitalUniversity of Electronic Science and Technology of ChinaChengduChina Institute for Stem Cell and Regeneration Chinese Academy of ScienceBeijingChina Beijing Key Laboratory of Neural Regeneration and Repair Capital Medical UniversityBeijing 100069China

Sensory hair cells(HCs)in the cochlea cannot regenerate spontaneously in adult mammals after being damaged by external or genetic ***,several genes and signaling pathways are reported to induce cochlear HC regeneration at the early neonatal ***14 encodes a ribosomal protein that is involved in the regulation of cell differentiation and proliferation in ***,its roles in the cochlea have not been reported in ***,we specifically overexpressed rps14 in Lgr5+progenitor cells in the newborn mouse cochlea and found that rps14 conditional overexpression(cOE)mice had significantly increased the ectopic HCs,including inner and outer *** further explored the source of these ectopic HCs and found no EdU+supporting cells observed in the rps14 cOE *** lineage tracing results,on the other hand,revealed that rps14 cOE mice had significantly more tdTomato+HCs in their cochleae than control *** results indicated that regenerated HCs by cOE of rps14 are most likely derived from inducing the direct trans-differentiation of Lgr5+progenitor cells into ***,real-time qPCR results suggested that the transcription factor genes Atoh1 and Gfi1,which are important in regulating HC differentiation,were upregulated in the cochlear basilar membrane of rps14 cOE *** summary,this study provides in vivo evidence that,in the postnatal mouse cochlea,rps14 is a potential gene that can promote the spontaneous trans-differentiation of Lgr5+progenitor cells into *** gene may one day be exploited as a therapeutic target for treating hearing loss.

关键词： rps14 Lgr5+progenitor cells Ectopic hair cells Regeneration Proliferation Trans-differentiation

rps14调控内耳干细胞增殖与分化为毛细胞的研究

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Rps14调控内耳干细胞增殖与分化为毛细胞的研究

作者：胡晓婕东南大学

学位级别：硕士

感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss,SNHL)是内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。据相关数据表明,我国绝大多数听力障碍患者均为感音神经性耳聋,其常见病因多为耳蜗部位出现病变。由于人类毛细... 详细信息

感音神经性耳聋(Sensorineural Hearing Loss,SNHL)是内耳、耳蜗神经、脑干听觉通路及听觉中枢病变导致的听力下降的统称。据相关数据表明,我国绝大多数听力障碍患者均为感音神经性耳聋,其常见病因多为耳蜗部位出现病变。由于人类毛细胞无法再生,毛细胞的损伤不可逆,因此感音神经性耳聋在临床上尚无有效的治疗方法。临床上常用的助听装置、人工耳蜗等治疗效果受耳蜗和听觉传入通路的严重程度和类型的限制,因此这些设备的应用具有一定局限性。内耳干细胞的发现使毛细胞再生成为了可能。干细胞具有自我更新和分化潜能,包括胚胎干细胞和成体干细胞。研究表明,内耳中的Lgr5阳性支持细胞具有内耳干细胞的特性,在损伤条件下可以再生具有一定功能的毛细胞。Lgr5阳性支持细胞分化为毛细胞的过程受多种信号通路调控如常见的经典Wnt、Notch信号通路。尽管如此,再生的毛细胞仍然不具有成熟毛细胞的结构与生理功能。因此,揭示毛细胞发育与分化的过程,筛选新的调控内耳干细胞分化为毛细胞的新基因,对功能性毛细胞再生至关重要。前期我们研究了Lgr5阳性支持细胞与Lgr5阴性支持细胞表达谱的差异,筛选发现rps14可能具有促进内耳干细胞增殖和分化为毛细胞的潜力。因此,本研究利用靶向内耳干细胞的腺相关病毒AAV-ie,在体外培养的新生鼠内耳干细胞中过表达rps14后,在二维培养条件下,显著促进了内耳干细胞的增殖。在三维培养条件下,过表达rps14能够促进来自内耳类器官中干细胞的增殖和毛细胞的分化。同样,在小鼠耳蜗内,我们利用AAV-ie-rps14感染支持细胞后,细胞的增殖能力得到提升,同时更多的细胞转分化形成新生毛细胞。机制上,为了确定rps14调控内耳干细胞细胞增殖和分化的信号通路,我们利用RNA-Seq分析比较了AAV-ie-rps14过表达的内耳干细胞和阴性对照组细胞的差异表达基因,获得了rps14基因关联的信号通路及可能发生相互作用的蛋白质。rps14主要是通过激活Wnt信号通路,调控一些细胞周期因子来促进内耳干细胞增殖,如Id3,通过抑制Notch,激活TGF-β信号通路生成新的毛细胞。综上,我们发现过表rps14能够有效调控内耳干细胞的增殖和毛细胞的分化。研究结果将为临床上以AAV为载体,通过基因治疗恢复听觉功能奠定理论和临床应用基础。

关键词：感音神经性耳聋内耳干细胞毛细胞 rps14 AAV-ie

rps14基因过表达对人MDS细胞株MUTZ-8增殖的影响

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RPS14基因过表达对人MDS细胞株MUTZ-8增殖的影响

作者：罗静重庆医科大学

学位级别：硕士

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是累及造血干细胞的异质性克隆性疾病，以无效造血及高风险向急性白血病转化为特征。目前本病预后差，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，对改善MDS的预后... 详细信息

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是累及造血干细胞的异质性克隆性疾病，以无效造血及高风险向急性白血病转化为特征。目前本病预后差，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，对改善MDS的预后具有重要意义。5号染色体长臂缺失是MDS普遍存在的染色体异常之一，研究发现缺失的区域均包括5q31-5q32，该区域称为共缺失区域(common deleted region，CDR)。rps14(ribosomal protein S14, rps14)基因位于该区域，表达量明显下降。我们的前期研究已经表明，伴de（l5q-）MDS患者体内rps14基因表达水平下降，rps14在MDS的发病发展中起着很重要的作用。本实验通过构建携带人rps14基因的重组慢病毒载体pGC-FUrps14-GFP，并将构建成功的重组慢病毒载体感染人MDS细胞株MUTZ-8细胞，增高目的基因在靶细胞内的表达水平，再通过细胞毒力实验、凋亡率的变化来观察rps14表达水平增高后对MUTZ-8细胞增殖、凋亡的影响。方法： 1、携带人rps14基因的重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP的构建及鉴定：选用慢病毒pGC-FU-EGFP为载体，首先设计合成rps14PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP，逐孔稀释法测定病毒滴度;采用流式细胞仪检测感染效率，RT-PCR及Westernblot检测感染前后目的细胞内rps14mRNA及rps14蛋白的表达变化。 2、重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP感染MUTZ-8细胞后对其增殖影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组(MUTZ-8)、空病毒感染组、感染组，应用噻唑蓝（MTT）法测定各组细胞的OD值，绘制生长曲线。 3、重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP感染MUTZ-8细胞后对其凋亡影响的研究：将实验细胞分组为：未感染组(MUTZ-8)、空病毒感染组、感染组，应用流式细胞仪测定各组细胞的凋亡率。结果： 1、本实验成功构建了重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP，滴度达2.0×109Tu/ml，构建的慢病毒载体能够高效率的感染MUTZ-8细胞，100MOI的重组慢病毒载体对MUTZ-8细胞的感染效率约为（51.303±3.908）%，RT-PCR、Western blot检测均显示感染后目的细胞rps14mRNA及蛋白的表达水平高于感染前。 2、重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP感染MUTZ-8细胞后抑制其增殖：感染后2d、3d、4d、5d，收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的吸光度值，感染重组慢病毒载体后对MUTZ-8细胞的生长有抑制作用，与空病毒感染组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）。 3、重组慢病毒载体pGC-FU rps14-GFP感染MUTZ-8细胞后促进其凋亡：流式细胞术检测感染前后细胞的凋亡率变化，感染重组慢病毒载体后MUTZ-8细胞凋亡率为（26.233±3.095）%，显著高于空病毒感染组细胞的凋亡率(P＜0.05)。结论： 1、慢病毒载体可以高效率感染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗研究具有重要的临床应用价值;2、rps14基因表达水平增高抑制人MDS细胞株MUTZ-8细胞的增殖;3、rps14基因表达水平增高促进人MDS细胞株MUTZ-8细胞的凋亡;4、rps14基因在MDS的发生发展中起着很重要的作用，本研究为进一步将rps14作用MDS的分子靶标研究提供了实验数据。

关键词：骨髓增生异常综合征 rps14 MUTZ-8 增殖慢病毒载体

拟南芥rps14基因的克隆表达及功能初步研究

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生物技术通报 2013年第1期29卷 73-77页

作者：范艳荣刘莹张飞云首都师范大学生命科学学院北京100048

拟南芥rps14(Ribosomal protein S14)是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白,是核糖体40S亚基的组成成分,属于S11P核糖体蛋白家族,主要负责RNA转录后加工。提取拟南芥总RNA,用RT-PCR技术得到rps14全长基因,经T-A克隆插入到pEASY-T3载体上... 详细信息

拟南芥rps14(Ribosomal protein S14)是从拟南芥中分离出的一种核糖体蛋白,是核糖体40S亚基的组成成分,属于S11P核糖体蛋白家族,主要负责RNA转录后加工。提取拟南芥总RNA,用RT-PCR技术得到rps14全长基因,经T-A克隆插入到pEASY-T3载体上。利用亚克隆法成功构建pGEX-6P-1-rps14原核表达质粒。GST-rps14融合蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,分子量约为43 kD。运用同样方法构建pET-28a-AK6原核表达质粒,获得大小约为26 kD的HIS-AK6融合蛋白。运用体外pull-down技术,并用SDS-PAGE和Western blot进行验证,证明拟南芥rps14蛋白与AK6蛋白之间存在相互作用。因此,推测拟南芥的AK6与rps14蛋白共同参与核酸代谢过程,影响RNA转录后加工,进而抑制拟南芥茎细胞的生长,使植株表现矮小特征。

关键词：拟南芥 rps14 AK6 Pull-down

肉鸡肺动脉JAZF1和rps14蛋白多克隆抗体的制备及其在肉鸡腹水综合征中的表达量分析

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肉鸡肺动脉JAZF1和RPS14蛋白多克隆抗体的制备及其在肉鸡腹水综合...

作者：顾玥明江西农业大学

学位级别：硕士

作为核糖体蛋白S14(rps14)的重要调控因子,与另一锌指并列蛋白1(JAZF1)会通过维持核糖体亚基组分之间的平衡来调控核糖体的生物合成以及重要蛋白质的翻译。本研究旨在探讨JAZF1和rps14蛋白在肉鸡腹水综合征(BAS)中的潜在作用。以制备的... 详细信息

作为核糖体蛋白S14(rps14)的重要调控因子,与另一锌指并列蛋白1(JAZF1)会通过维持核糖体亚基组分之间的平衡来调控核糖体的生物合成以及重要蛋白质的翻译。本研究旨在探讨JAZF1和rps14蛋白在肉鸡腹水综合征(BAS)中的潜在作用。以制备的多克隆抗体为基础,分析了JAZF1和rps14蛋白在家禽和哺乳动物重要组织中的表达水平和定位分布。本试验利用TA克隆、亚克隆技术构建重组表达质粒PET32a-JAZF1和PET28a-rps14(宿主菌株是:Rosetta和BL21)。之后,将IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导原核表达的His-JAZF1和His-rps14融合蛋白(30k Da和22 k Da)纯化后作为抗原制备高质量的抗血清。经由酶联免疫吸附测定、蛋白质印迹法以及间接免疫荧光等技术对多克隆抗体的质量效果、反应原性以及病鸡关键组织中相应蛋白的表达变化进行了分析。试验结果表明:(1)本试验构建了PET32a-JAZF1和PET28a-rps14表达载体,经由IPTG诱导原核表达,并将获得的重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,进而成功提取、分离兔抗鸡JAZF1和rps14蛋白多克隆抗体。(2)这两种抗体能特异性识别肉鸡重要组织中的JAZF1和rps14蛋白,其效价分别高达1:102,400和1:204,800。(3)免疫荧光显示JAZF1和rps14蛋白主要定位于肉鸡、肉鸭、山羊、小鼠和兔子的肺动脉、肝、肾、心和肺组织细胞的细胞质中。(4)通过对平均荧光强度的半定量分析发现这些蛋白在肉鸡和肉鸭的组织中的表达量比在哺乳动物中更加显著(Prps14蛋白的表达水平显著降低(Prps14蛋白多克隆抗体。同时,应用此抗体探究了JAZF1和rps14蛋白在肉鸡腹水综合征发生发展过程中的表达变化,并定位了两种蛋白在各种动物相关组织中的分布。本文为进一步研究JAZF1和rps14蛋白在肉鸡腹水综合征中的关键作用奠定了理论基础,也为JAZF1和rps14蛋白生物学功能研究提供了新的切入点。

关键词： JAZF1 rps14 肉鸡腹水综合征多克隆抗体荧光定位

miR-146b-5p结合rps14蛋白促进鸭坦布苏病毒增殖的初步研究

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miR-146b-5p结合RPS14蛋白促进鸭坦布苏病毒增殖的初步研究

作者：雷林四川农业大学

学位级别：硕士

microRNA(miRNA)是一种非编码小RNA分子。在病毒感染中,miRNA能通过调节基因转录来调控病毒的增殖。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是黄病毒科黄病毒属单链正股RNA病毒,主要感染禽类。miRNA在其它黄病毒感染中生物学功能已有... 详细信息

microRNA(miRNA)是一种非编码小RNA分子。在病毒感染中,miRNA能通过调节基因转录来调控病毒的增殖。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus,DTMUV)是黄病毒科黄病毒属单链正股RNA病毒,主要感染禽类。miRNA在其它黄病毒感染中生物学功能已有许多报道,但在DTMUV感染鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast,DEF)中相关报道较少。研究DTMUV与宿主miRNA的相互作用,对阐释DTMUV感染宿主机制提供重要理论依据。实验室前期预示试验表明,DTMUV感染DEF细胞引起miR-146b-5p大量表达,而关于miR-146b-5p有何功能?尚无相关报道。为此开展相关研究,结果报道如下。***-146b-5p 促进 DTMUV 的增殖DTMUV感染DEF细胞12h、24h、36h、48h后发现:细胞内miR-146b-5p表达出现时间依赖性上升趋势。qRT-PCR和western blot和病毒滴度分析显示:将miR-146b-5p模拟物(mimic)转染到DEF细胞后,细胞上清液中病毒滴度显著升高(P＜0.01),DTMUV拷贝数显著增多(P＜0.001),DTMUV E蛋白表达增加。但在转染miR-146b-5p抑制剂(inhibitor)后,均出现显著降低。结果均表明miR-146b-5p可以促进DTMUV增殖。***-146b-5p结合宿主rps14蛋白RNA pull-down实验沉淀miR-146b-5p结合蛋白复合物并对其进行质谱定性分析。检测到130段多肽以及40个已知蛋白质,其中miR-146b-5p的特异性结合蛋白17个。根据蛋白质匹配分数,检测感染DTMUV后rps14、Hsp70A8、SRPRB等蛋白mRNA表达变化,结果表明只有rps14mRNA表达呈现先上升后下降规律性变化,表达水平在36h最高。扩增rps14核酸序列并以真核表达质粒pCAGGS为载体构建pCAGGS-rps14 重组质粒。将 pCAGGS-rps14 质粒转染 DEF 细胞,western blot 验证 miR-146b-5p能与rps14结合。***14降低DTMUV的拷贝数和E蛋白表达设计并合成shRNA干扰rps14表达。检测rps14对DTMUV复制的影响,结果显示:转染pCAGGS-rps14重组质粒过表达rps14后,病毒拷贝数和病毒E蛋白表达量显著减少(Prps14表达后,病毒拷贝数和病毒E蛋白表达量显著增多(Prps14可以降低DTMUV的复制,敲低rps14可以促进DTMUV的复制。***-146b-5p通过结合抑制rps14促进DTMUV增殖检测miR-146b-5p对rps14 mRNA和蛋白表达的作用,发现过表达miR-146b-5p使rps14 mRNA水平和蛋白表达量显著降低(P146b-5p表达使rps14 mRNA水平和蛋白表达量显著升高(P146b-5p能抑制rps14表达。pCAGGS-rps14重组质粒与miR-146b-5p共同转染入DEF细胞并接毒后,检测病毒拷贝数和病毒E蛋白表达。结果显示共转pCAGGS-rps14和miR-146b-5p mimic后病毒拷贝数和E蛋白表达显著增多(Prps14 shRNA和miR-146b-5p mimic共同转染到DEF细胞并接毒,检测病毒拷贝数和病毒E蛋白表达。结果表明共转4shRNA和miR-146b-5p mimic后病毒拷贝数和蛋白表达无显著差异(P>0.05)。综上,本试验发现miR-146b-5p可以通过结合抑制rps14促进DTMUV增殖。

关键词： miR-146b-5p rps14 DTMUV miRNA

shRNA沉默rps14基因对MDS细胞株SKM-1细胞增殖的影响

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shRNA沉默RPS14基因对MDS细胞株SKM-1细胞增殖的影响

作者：蒋文重庆医科大学

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目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是一组起源于多能造血干/祖细胞的异质性恶性血液疾病，以高风险向急性白血病转化为其特征，故又俗称白血病前期（Preleukemia，PL）。目前本病的发病机制尚未阐明，缺乏有... 详细信息

目的：骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome, MDS）是一组起源于多能造血干/祖细胞的异质性恶性血液疾病，以高风险向急性白血病转化为其特征，故又俗称白血病前期（Preleukemia，PL）。目前本病的发病机制尚未阐明，缺乏有效的治疗手段。因此，探索MDS的分子发病机制，寻找MDS的有效治疗手段具有重要意义。MDS最常见的染色体缺失是5号染色体长臂的缺失，所有伴有del(5q)的MDS患者染色体缺失区域均含有5q31-5q32区带，称为共缺失区域（commondelete region, CDR）。对CDR的基因测序研究未发现显性突变，均表现为基因表达量的下降。其中，位于该区域的rps14基因，是单倍剂量减少的抑癌基因，近年研究表明，伴有del(5q)的MDS患者体内rps14基因表达水平下降。而对于5号染色体表型正常的MDS患者体内rps14基因表达变化是否也具有同样的意义目前尚未有研究报道。因此，研究rps14在MDS发生发展中的作用具有重要意义。本实验通过构建rps14基因RNAi慢病毒载体（Lentiviral Vector，LV），观察该基因在人MDS细胞株SKM-1细胞中的表达，并将构建成功的重组慢病毒载体rps14-shRNA转染人MDS细胞株SKM-1细胞，使目的基因在靶细胞内表达沉默。以便深入研究rps14基因对MDS细胞内生物学行为的影响。通过细胞增殖率变化等方法观察rps14基因表达沉默后对SKM-1细胞增殖的影响。方法：1、rps14基因RNAi慢病毒载体rps14-shRNA的构建及鉴定：选用新型慢病毒载体pGC-SIL-GFP，首先设计合成rps14互补脱氧核糖核酸（Complementary deoxynucleic acid，cDNA）的PCR产物与线性化慢病毒载体相连接，产物经测序鉴定确认，与包装质粒共转染293T细胞，产生重组慢病毒载体rps14-shRNA，逐孔稀释法测定病毒滴度;采用流式细胞仪检测转染效率，Western blot检测转染前后目的细胞内rps14蛋白的表达变化。2、重组慢病毒载体rps14-shRNA转染SKM-1细胞后对其增殖影响的研究：将重组慢病毒载体rps14-shRNA转染SKM-1细胞（转染组），同时设立未转染组(SKM-1)、空载体转染组，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法测定各组细胞的光密度值（Optical density，OD）。结果：1、本实验成功构建了重组慢病毒载体rps14-shRNA，滴度达2.0×109TU/ml,构建的慢病毒载体能够高效率的转染SKM-1细胞，100感染复数（Multiplicity of infection，MOI）的重组慢病毒载体对SKM-1细胞的转染效率约为58.26%，Western blot检测显示转染后靶细胞rps14蛋白的表达水平明显低于转染前，实验组与对照组比较具有统计学意义（P＜0.01）。2、重组慢病毒载体rps14-shRNA转染SKM-1细胞后抑制其增殖：转染48h、72h、96h,收集各组细胞，MTT法检测各组细胞的OD值,转染重组慢病毒载体后对SKM-1细胞的生长有抑制作用，与空载体转染组相比具有统计学意义（P＜0.05）。结论1、慢病毒载体可以高效率的转染血液肿瘤细胞，对血液肿瘤的分子治疗具有重要的临床应用价值。2、对于5号染色体表型正常的MDS细胞株SKM-1细胞rps14基因表达沉默可抑制其增值。3、本研究结果表明rps14基因在MDS的发生发展中起着重要作用。

关键词： rps14 SKM-1细胞 RNA干扰骨髓增生异常综合征

核糖体蛋白rps14泛癌分析及对肝癌细胞功能影响的研究

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核糖体蛋白RPS14泛癌分析及对肝癌细胞功能影响的研究

作者：袁鑫宇内蒙古大学

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核糖体蛋白是核糖体组成的主要成分,参与核糖体大小亚基的装配维持核糖体稳定、调控翻译,参与DNA修复、细胞凋亡等功能。核糖体蛋白rps14在肿瘤中有多种调控机制,然而rps14在泛癌中的综合分析及在肝癌中的调控作用仍有待研究。为了探索R... 详细信息

核糖体蛋白是核糖体组成的主要成分,参与核糖体大小亚基的装配维持核糖体稳定、调控翻译,参与DNA修复、细胞凋亡等功能。核糖体蛋白rps14在肿瘤中有多种调控机制,然而rps14在泛癌中的综合分析及在肝癌中的调控作用仍有待研究。为了探索rps14在不同肿瘤中的功能,我们首先在33种肿瘤和对应正常组织数据中进行差异表达分析,发现rps14在多种肿瘤中存在显著表达差异;COX检验发现在12种癌症中rps14与生存分析显著相关,初步表明其在肿瘤病人中的预后价值。同时,基于rps14与免疫检查点及免疫浸润的关系的分析,我们发现rps14表达与包括程序性死亡受体1(PDCD1/PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)在内的60个免疫检查点基因显著相关,与免疫细胞浸润、肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性显著相关;显示rps14在多种肿瘤中可能通过参与免疫调节影响预后。之后我们选取了差异表达并且预后差的肝癌作为研究对象,进一步研究rps14在肝癌中的调控作用。在肝癌中进行功能富集分析,富集到了代谢相关通路;为了确定rps14在肝癌代谢调控中的具体作用,我们对敲低rps14的肝癌细胞系Huh7进行非靶向代谢组测序,在正离子模式下筛选到了258个差异代谢物,负离子模式下筛选到了133个差异代谢物,这些差异代谢物富集到了26条代谢通路如氨基酸代谢、ABC转运蛋白、氨基糖和核苷酸糖代谢等,这些通路都在癌症调控中发挥重要的作用。为了验证rps14对肝癌细胞的影响,我们对敲低rps14的肝癌细胞进行生物学功能验证,发现肝癌细胞周期阻滞在G0/G1期、细胞凋亡显著上升,肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力受到抑制,p53、p21、BAX表达上调。进一步进行非靶向代谢组分析及实验,发现ABC转运蛋白家族成员ABCA1、ABCA9、ABCB11、ABCB10、ABCG5表达上调,表明rps14在肝癌中可能通过调节ABC转运蛋白表达影响肿瘤代谢途径进而发挥促癌作用。综上所述,通过泛癌分析我们确定了rps14在肿瘤中具有显著的预后价值和免疫治疗的潜力。肝癌细胞系的非靶向代谢组数据分析显示rps14参与代谢通路的调控,其可能通过影响细胞代谢调节肝癌细胞的生物学功能。最后进一步验证rps14具有促进肝癌细胞进程的作用,这一作用可能与调控p53通路及ABC转运蛋白家族表达有关,以上结果显示rps14具有成为肝癌预后的靶标的潜力。

关键词：核糖体蛋白 rps14 泛癌肝癌

rps14基因RNAi慢病毒载体构建及在SKM-1细胞中的表达

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中国组织工程研究 2012年第45期16卷 8491-8495页

作者：蒋文罗静刘林肖青杨泽松王利重庆医科大学附属第一医院血液科重庆市400016

背景:有研究表明,造血干/祖细胞内rps14表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示rps14的正常表达有助于维持机体的正常造血。目的:构建rps14基因RNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞... 详细信息

背景:有研究表明,造血干/祖细胞内rps14表达减少可导致造血细胞病态造血,尤其是向红系分化受阻,提示rps14的正常表达有助于维持机体的正常造血。目的:构建rps14基因RNAi慢病毒载体,并观察该基因在人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1细胞中的表达。方法:针对已经筛选确定的rps14基因RNAi有效靶序列,构建GC-shrps14慢病毒载体并测序鉴定。用GC-shrps14、pHelper1.0载体和pHelper2.0载体共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度;并将获得的rps14shRNA慢病毒载体GC-shrps14转染人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1,用Western Blot检测靶细胞内rps14蛋白的表达。结果与结论:经测序证实,构建出了rps14shRNA的慢病毒载体GC-shrps14。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为2×109TU/mL。荧光显微镜下能直接观察到转染组细胞的GFP表达,转染效率为75%,WesternBlot检测到转染后rps14在靶细胞中表达明显被抑制。说明成功构建rps14基因RNAi慢病毒载体,转染人SKM-1细胞株后rps14蛋白表达沉默。

关键词：骨髓增生异常综合征 rps14 RNA干扰慢病毒载体 SKM-1细胞