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rpa1对B淋巴细胞发育及功能的调控

RPA1对B淋巴细胞发育及功能的调控

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作者：万思铎锦州医科大学

学位级别：硕士

目的通过Loxp-Cre系统在以C57BL/6鼠为背景,在特定阶段利用Mb1 cre在B细胞上敲除rpa1(Replication Protein A 1),来探寻rpa1对B细胞发育的影响。方法首先通过剪尾并使用PCR的方法去鉴定小鼠的基因型,并根据孟德尔定律合理分笼。其次在... 详细信息

目的通过Loxp-Cre系统在以C57BL/6鼠为背景,在特定阶段利用Mb1 cre在B细胞上敲除rpa1(Replication Protein A 1),来探寻rpa1对B细胞发育的影响。方法首先通过剪尾并使用PCR的方法去鉴定小鼠的基因型,并根据孟德尔定律合理分笼。其次在小鼠的合适周龄时,对小鼠进行取血并用Elisa技术检测各种免疫球蛋白的含量,之后通过分离小鼠的骨髓组织并染色使用流式细胞术的技术去探寻rpa1对B细胞发育的影响,并最后通过流式分选的技术分选出特定阶段细胞群,并提取RNA后做RT-PCR,对B系的转录因子的表达进行检测。结果首先在使用正常小鼠和敲除小鼠的血清做完Elisa后,发现敲除小鼠的IgM,IgG,IgA浓度均很低,基本检测不到;之后通过流式细胞术对正常鼠和敲除鼠的骨髓,脾进行B细胞发育以及成熟B细胞分型检测后发现,小鼠外周的大部分成熟B细胞均检测不到或数量很少,如:B1,B2细胞,MZB(Marginal zone B)。而敲除小鼠的骨髓里发现小鼠的B细胞阻滞在了 Pro-B阶段,通过多种表面标志细分后,发现阻滞在了 Pre-Pro-B阶段,在对此阶段的细胞进行RT-PCR检测后,发现许多对B系发育非常重要的转录因子皆不表达或降低,最后发现是E2A-Ebf-Pax5通路中以Ebf,Pax5的完全不表达,E2A表达下调的一个表型,表明rpa1或许与E2A通路有着某种未知的联系。结论通过在B细胞早期对rpa1的敲除发现,rpa1并不仅仅是我们普遍认为的DNA修复蛋白,目前来看至少是一个对B细胞发育尤为重要的一个因子,机制很有可能与E2A-Ebf-Pax5通路具体与E2A互相作用或其他方式去起作用。

关键词： rpa1 B cell E2A Ebf Pax5

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减数分裂同源重组相关基因与犏牛雄性不育关系的研究

减数分裂同源重组相关基因与犏牛雄性不育关系的研究

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作者：李贤南京农业大学

学位级别：硕士

黄牛和牦牛杂交F1代犏牛雄性不育是牦牛杂交改良和杂种优势利用的最大障碍,因此探明F1代犏牛雄性不育的机理成为牦牛杂交育种与改良亟待解决的重要问题。研究发现犏牛雄性不育可能与精母细胞减数分裂过程中DNA分子的损伤尤其是DNA双链... 详细信息

黄牛和牦牛杂交F1代犏牛雄性不育是牦牛杂交改良和杂种优势利用的最大障碍,因此探明F1代犏牛雄性不育的机理成为牦牛杂交育种与改良亟待解决的重要问题。研究发现犏牛雄性不育可能与精母细胞减数分裂过程中DNA分子的损伤尤其是DNA双链断裂（double strand break, DSB）有关。Dmcl （disrupted meiotic cDNA）. Rad51（recombination protein A）、rpal（replication protein A,rpa）和BLM（Bloom syndrome protein）基因是参与哺乳动物减数分裂同源重组修复的关键基因,这些基因的突变、敲除和表达水平的降低均会引起精母细胞减数分裂障碍,最终导致雄性不育。为探讨减数分裂期同源重组相关基因与犏牛雄性不育的关系,本文采用RT-PCR克隆测序、荧光定量PCR和生物信息学的方法对Dmcl、Rad5l、rpal和BLM基因进行了分析,结果如下： 1.黄牛、牦牛和犏牛Dmcl基因的克隆、序列分析及表达的研究根据黄牛Dmcl基因序列设计引物扩增出牦牛和犏牛睾丸组织Dmcl基因部分cDNA序列,全长均为1059bp,两段序列包含完整的ORF,全长为1023bp,编码340个氨基酸。生物信息学分析发现,犏牛氨基酸序列与黄牛和牦牛的同源性为100%,与其他动物也具有较高的同源性;牛Dmcl与其它物种一样,含有大肠杆菌（***） RecA蛋白家族保守的第二结构域部分,包括两个核苷酸结合位点和DNA结合区,说明Dmcl蛋白在功能和进化上是高度保守的,推测牛Dmcl与人、鼠一样,在精母细胞减数分裂同源重组过程发挥重要作用。系统发育分析发现,黄牛、牦牛和犏牛首先聚为一类,然后再与其他哺乳动物聚类,与鸟纲动物距离较远,与经典分类学方法一致。实时荧光定量PCR显示,Dmcl基因在犏牛睾丸组织中的表达水平极显著低于黄牛和牦牛睾丸组织的表达水平（P＜0.01）,且犏牛表现出来的减数分裂障碍表型与小鼠Dmcl基因突变或敲除的表型一致,推测Dmcl基因可能与犏牛的雄性不育可能有一定的关系,是犏牛雄性不育的候选基因。 2.黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Rad51基因mRNA表达水平研究根据黄牛Rad51基因序列设计引物,并以黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织RNA为模板,通过荧光定量PCR检测犏牛及其亲本睾丸组织中Rad51基因的表达水平,结果表明：Rad51基因在黄牛睾丸组织中的表达量最高,犏牛次之,牦牛最低,但差异均不显著,说明Rad5l基因的mRNA表达水平可能与犏牛的雄性不育无关,而牦牛和犏牛睾丸组织Rad5l基因的低表达可能与其所生活的环境也有一定的关系。 3.黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中rpal基因mRNA表达水平研究根据黄牛rpal基因序列设计引物,并以黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织RNA为模板,通过荧光定量PCR检测犏牛及其亲本睾丸组织中rpal基因的表达水平,结果表明：rpal基因在犏牛睾丸组织中的表达水平显著高于其在黄牛、牦牛睾丸组织中的表达水平,差异显著（P＜0.05）,说明rpal基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育可能有一定关系。 4.黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中BLM基因nRNA表达水平研究根据黄牛BLM基因序列设计引物,并以黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织RNA为模板,通过荧光定量PCR检测犏牛及其亲本睾丸组织中BLM基因的表达水平,结果表明：BLM基因在黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中都有表达,但差异不显著（P＞0.05）,说明BLM基因的mRNA表达水平可能与犏牛雄性不育无关。因此,犏牛雄性不育可能是由Dmcl基因表达水平偏低或rpal基因表达水平偏高造成的,部分同源重组基因的低表达或高表达可能与犏牛雄性不育有关。

关键词： Dmc1 Rad51 rpa1 BLM 犏牛雄性不育表达水平

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