检索结果-南通市图书馆

作者：徐凡昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]子宫颈癌（cervical cancer,CC）是女性恶性肿瘤死亡的常见原因,全世界每年新发病例约50余万,而发展中国家的子宫颈癌患者占比就高达80%。虽然诸多学者对子宫颈癌中肿瘤细胞的相关信号通路进行了深入探索研究,但其具体发病机制... 详细信息

[目的]子宫颈癌（cervical cancer,CC）是女性恶性肿瘤死亡的常见原因,全世界每年新发病例约50余万,而发展中国家的子宫颈癌患者占比就高达80%。虽然诸多学者对子宫颈癌中肿瘤细胞的相关信号通路进行了深入探索研究,但其具体发病机制仍不明确。微小RNA（microRNA,miRNA）通过与下游靶基因的信使RNA（messenger RNA,mRNA）的 3’-非编码区（3’untranslated regions,3’-UTR）结合,从而达到抑制下游靶基因表达的作用。研究表明,miR-1246作为参与肿瘤发生发展过程中重要的miRNA,可促进子宫颈癌的进展。本研究拟在HeLa细胞中研究miR-1246对其增殖、侵袭和迁移功能的影响,并探讨其相关分子调控机制,旨在找到针对子宫颈癌的有效诊治靶点,从而寻求有效的诊治方法,为子宫颈癌的精准治疗打下一定的基础。[方法]1.在HeLa细胞中,过表达miR-1246后,检测miR-1246的表达情况,利用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU）、CCK-8 实验（Cell Counting Kit-8,CCK-8）、Transwell迁移及侵袭实验检测细胞增殖活性、迁移和侵袭能力。2.利用生物信息学方法预测miR-1246下游靶基因维甲酸相关孤儿受体α（Retinoid-related orphan receptor-alpha,rora）,同时应用实时定量聚合酶链式反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测过表达miR-1246后miR-1246及rora的表达情况,最后应用双荧光素酶活性报告基因实验验证rora为miR-1246的靶基因。3.用小RNA（siRNA）干扰rora表达后利用蛋白印迹法（Western blot,WB）检测rora的表达情况,利用CCK-8、Transwell迁移及侵袭方法检测细胞增殖活性、迁移和侵袭能力。4.利用挽救实验,在过表达miR-1246的宫颈癌细胞中外源过表达rora,验证miR-1246对子宫颈癌细胞增殖、迁移的促进作用是通过下调rora来实现的。[结果]1.与 Blank 组（1.45±0.27）和 miRNC 组（1.67±0.26）相比,miR-1246 mimic组（79.88±5.23）中 miR-1246 的表达量明显增高（P＜0.05）。Blank组、miRNC组和miR-1246 mimic组EdU染色阳性细胞率分别为（48.42±1.30）%、（51.39±6.41）%和（74.92±3.82）%,CCK-8 实验 OD 值分别为 0.87±0.02、0.87±0.03和 1.02±0.03,提示 miR-1246 促进 Hela 细胞增殖（P＜0.05）;Transwell 迁移实验细胞迁移数目分别为80.20±5.07、81.40±5.18和132.60±5.98/高倍视野,Transwell侵袭实验细胞侵袭数目分别为36.80±5.07、36.20±5.31和71.20±5.12/高倍视野,显示miR-1246 mimic促进HeLa细胞的迁移及侵袭能力（P＜0.05）。2.利用miRBase数据库查找及TargetScan软件检测,结果显示miR-1246在rora基因3’-UTR区域存在可能的结合位点。与Blank组（1.06±0.17）和miRNC组（1.24±0.24）相比,miR-1246 mimic 组（79.75±5.31）细胞中 miR-1246 的表达水平明显增高（P＜0.05）;与 Blank 组（0.98±0.02）和 miRNC 组（0.94±0.05）相比,miR-1246 mimic组（0.33±0.05）细胞中rora mRNA的表达明显下调（P＜0.05）。荧光素酶报告基因实验结果显示,与mimic NC（1.15±0.17）相比,miR-1246（0.38±0.10）显著抑制野生型rora 3’-UTR荧光酶素报告基因活性（P＜0.05）,而 miR-1246 mimic（1.13±0.27）和 mimic NC（1.08±0.15）对 miR-1246结合位点突变型的rora 3’-UTR荧光酶素报告基因活性的影响则没有显著差异（P＞0.05）,提示 miR-1246 特异性靶向 rora 3’-UTR。3.与Blank组和si-NC组相比,si-rora有效抑制HeLa细胞rora的表达水平（P＜0.05）。Blank组、si-NC组和si-rora组CCK-8实验OD值分别为0.89±0.02、0.88±0.02和1.05±0.03,提示敲低rora表达显著促进HeLa细胞增殖（P＜0.05）;Blank组、si-NC组和si-R

关键词：子宫颈癌 miR-1246 rora

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miR-18a-5p靶向调控rora在结直肠癌增殖进展中的作用及临床意义

miR-18a-5p靶向调控RORA在结直肠癌增殖进展中的作用及临床意义

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作者：王帅甘肃中医药大学

学位级别：硕士

背景与目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤。虽然近年来CRC在检查手段和治疗方法上有了很大的提升,但CRC患者的5年生存率并没有得到根本改善,因此探索CRC发生发展的关键分子靶点,从而研发新的靶向药物迫... 详细信息

背景与目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种常见的消化道恶性肿瘤。虽然近年来CRC在检查手段和治疗方法上有了很大的提升,但CRC患者的5年生存率并没有得到根本改善,因此探索CRC发生发展的关键分子靶点,从而研发新的靶向药物迫在眉睫。microRNA(miRNA)在调控肿瘤的发生发展起着关键作用,可以正向调控促进肿瘤的发生发展,也可负向调控抑制肿瘤进展。研究发现microRNA-18a-5p(miR-18a-5p)具有调控多种肿瘤发生发展的作用,但miR-18a-5p在CRC中的作用及机制尚不明确。本研究旨在通过探讨miR-18a-5p及其靶基因维甲酸相关孤核受体A(rora)在CRC中发挥的作用及其临床意义,从而为CRC诊疗的分子靶点探索提供实验依据。方法:1.基于公共数据库分析miR-18a-5p和rora在CRC中的表达水平及二者的相关性。2.实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-timePCR,qRT-PCR)检测miR-18a 5p和rora mRNA在CRC组织和癌旁组织中表达量;荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)和免疫组化(Immunohistochemistry,IHC)方法检测 CRC组织中miR-18a-5p和rora的表达情况。3.基于30例CRC患者的临床资料,运用卡方检验分析miR-18a-5p表达水平与CRC患者临床病理特征之间的关系。4.qRT-PCR检测CRC 细胞株 HCT116、RKO、SW620、SW480 和人结直肠上皮细胞 HCoEpiC 中 miR-18a-5p和 rora mRNA 的表达水平。5.以 miR-18a-5p 模拟物(miR-18a-5p mimics)、miR-18a-5p抑制剂(miR-18a-5p inhibitor)以及相应阴性对照序列转染RKO细胞,qRT-PCR检测转染后RKO细胞中miR-18a-5p表达水平,以验证转染效率。6.细胞划痕实验和Transwell侵袭实验检测各稳定转染组RKO细胞的迁移和侵袭能力;EDU和CFSE细胞增殖实验检测各转染组RKO细胞的增殖能力;流式细胞术检测各转染组RKO细胞的凋亡率。7.生物信息学预测miR-18a-5p和rora基因结合位点信息,运用双荧光素酶基因报告实验检测miR-18a-5p对rora基因的靶向调控作用。8.qRT-PCR和蛋白免疫印迹实验(Western blot,WB)检测 miR-18a-5p 对 rora mRNA 和 RCRA 蛋白表达的影响。9.细胞功能挽救实验,将细胞分为 miR-18a-5p mimics NC 组,miR-18a-5p mimics 组,miR-18a-5p mimics+oe-rora组,oe-rora组,检测miR-18a-5p是否通过下调rora表达促进RKO细胞的恶性表型。10.生物信息学分析结合FISH和免疫荧光染色法验证miR-18a-5p和rora分别与经典免疫分子标志物CD8A表达的相关性。结果:1.通过查询在线公共数据库发现,miR-18a-5p和rora分别在CRC组织中显著高、低表达,并且二者的表达呈显著负相关。2.检测临床组织样本发现与癌旁组织相比,CRC组织中miR-18a-5p明显高表达,而rora呈低表达。3.miR-18a-5p高表达与CRC患者较差的临床病理特征密切相关。4.与正常结直肠上皮细胞HCoEpiC相比,miR-18a-5p在四株结肠癌细胞(HCT116、RKO、SW620、SW480)中的内源性表达显著增高,而rora的内源性表达则与之相反。5.过表达miR-18a-5p可显著促进RKO细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而沉默miR-18a-5p的内源性表达能够明显抑制RKO细胞的增殖、迁移和侵袭能力,同时诱发其凋亡能力。6.双荧光素酶基因报告实验发现miR-18a-5p mimics能够显著抑制rora基因3'UTR区的野生型序列荧光载体(rora-wt)的荧光活性,但对其突变型序列荧光载体(rora mut)则无此作用,故认为miR-18a 5p能够靶向结合 rora 的 3' UTR 区;RT-PCR 和 WB 结果显示 miR-18a-5p 的 mimics 和 inhibitor 分别显著下调、上调了 RKO细胞中rora的表达。7.细胞功能挽救实验发现转染miR-18a-5p mimics明显增强了 RKO细胞的侵袭能力,而同时转染mimics+oe-rora(rora过表达慢病毒载体)后该侵袭增强作用被有效消减,而单纯转染oe-rora则显著抑制了 RKO细胞的侵袭能力;同时发现相比转染mimics组,同时转染mimics+oe-rora显著提升了 RKO细胞的凋亡能力,并且单纯转染oe-rora能够

关键词： miR-18a-5p rora CD8A 结直肠癌增殖

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miR-125b-5p调控自噬逆转肺腺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性及其机制研究

miR-125b-5p调控自噬逆转肺腺癌A549/DDP细胞顺铂耐药性及其机制...

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作者：郭娜承德医学院

学位级别：硕士

据2020年全球癌症报告统计,肺癌全球新发病例高达220万,死亡病例高达180万,发病率及死亡率均居全球前列。其中,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)约占肺癌全部病例的40%,是一种高度恶性和异质性的疾病。LUAD起病隐匿,患者在确诊时已处... 详细信息

据2020年全球癌症报告统计,肺癌全球新发病例高达220万,死亡病例高达180万,发病率及死亡率均居全球前列。其中,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)约占肺癌全部病例的40%,是一种高度恶性和异质性的疾病。LUAD起病隐匿,患者在确诊时已处于病程晚期,此时,以铂类药物为主的联合化疗成为临床首选治疗方案。然而,化疗易导致耐药发生,患者预后差,死亡率高。微小RNA(micro RNA,miRNA)在肿瘤发生发展过程中扮演着重要的角色,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、血管生成及化疗耐药等多个生物学过程。研究发现,miRNA调控化疗耐药是多分子、多因素的复杂过程,主要机制包括:DNA损伤修复、上皮间充质转化、药物转运、氧化还原稳态和自噬等,但其中任何一种机制都不可能完全清楚阐述化疗耐药的发生。目前对具体miRNA调控化疗耐药的研究还较少,因此,迫切需要寻找新的miRNA分子并深入研究其耐药机制,降低LUAD化疗耐药的发生。本研究旨在利用生物信息学分析LUAD顺铂耐药与敏感相关miRNA微阵列,筛选并鉴定出差异表达的特定miRNA,通过实验验证其在顺铂耐药LUAD细胞中的异常表达情况;并深入探讨该分子参与LUAD顺铂耐药的分子机制。本研究可能对攻克LUAD顺铂化疗耐药,增强化疗疗效,改善患者预后都具有一定的意义。第一部分基于生物信息学分析肺腺癌顺铂耐药相关基因miR-125b-5p目的:应用生物信息学方法分析miR-125b-5p在LUAD中的表达,预测其靶基因及预后价值。方法:1.选取GEO(Gene Expression Omnibus)数据库中LUAD顺铂耐药相关组织芯片数据集GSE56036、GSE168707及顺铂耐药相关细胞芯片数据集GSE43249、GSE157692,应用R软件筛选差异表达miRNA,运用venny在线工具取交集,获得与耐药密切相关的差异表达miRNA。2.应用miRBase数据库分析miR-125b-5p保守性。3.采用db DEMC3.0数据库分析miR-125b-5p在泛癌中表达情况,同时,下载TCGA(the Cancer Genome Atlas)数据库中LUAD信息,进一步验证miR-125b-5p表达水平。4.利用Target Scan、miRDB、miRTar Base数据库预测miR-125b-5p靶基因,并将3个数据库的靶基因取交集。5.利用DAVID在线网站对上述交集靶基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析及京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG)生物通路富集分析。6.下载TCGA数据库LUAD患者生存信息,分析miR-125b-5p与LUAD预后的关系。7.实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)技术检测miR-125b-5p在人正常支气管上皮细胞系16HBE,LUAD细胞系A549,以及顺铂耐药细胞系A549/DDP中的表达水平。结果:1.4个LUAD顺铂耐药相关芯片差异表达分析结果显示,GSE56036中41个,GSE168707中20个,GSE43249中145个以及GSE157692中301个差异表达的miRNA,venny图取交集后获得与耐药密切相关的差异表达基因miR-125b-5p。2.miR-125b-5p序列在人、小家鼠、大鼠、家兔、猪、猕猴、马、蟾蜍等49个物种中完全一致,在物种间具有高度保守性。3.db DEMC3.0及TCGA数据库分析结果显示,miR-125b-5p在包含LUAD的21种肿瘤中表达水平下调。4.Target Scan、miRDB、miRTar Base数据库预测miR-125b-5p靶基因,取交集后获得54个基因。5.GO和KEGG结果显示,54个靶基因主要富集在调节基因表达、细胞大分子生物合成等过程;并显著富集于Micro RNAs in cancer、Protein processing in endoplasmic reticulum以及HIF-1 signaling pathway等通路。6.Kaplan-Meier生存分析结果提示,miR-125b-5p低表达与LUAD患者预后不良相关(P=0.010)。7.q RT-PCR结果显示,miR-125b-5p在A549细胞中表达水平显著低于16HBE(P=0.008);与亲本细胞相比,在耐药细胞A549/DDP中表达水平明显下降(P=0.023)。结论:基于生物信息学预测miR-125b-5p在LUAD中表达异常,其靶基因参与调控多个生物学过程及信号通路,miR-125b-5p可能是LUAD预后的生物标志物。第二部分miR-125b-5p通过rora/BNIP3L调控自噬逆转A549/DDP细胞顺铂

关键词：生物信息学肺腺癌顺铂耐药 miR-125b-5p 预后自噬 A549/DDP rora BNIP3L

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角质形成细胞通过外泌体作用于树突状细胞对银屑病的影响和机制研究

角质形成细胞通过外泌体作用于树突状细胞对银屑病的影响和机制研...

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作者：朱晓辰中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景及目的:银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病,累及全球约3%的人口,我国患病率约为0.47%。其组织病理特征是表皮角质形成细胞的过度增殖、异常分化和真皮炎症细胞的浸润,临床上表现为覆有银白色鳞屑的红色丘疹、斑块,常以头... 详细信息

研究背景及目的:银屑病是一种免疫介导的慢性炎症性皮肤病,累及全球约3%的人口,我国患病率约为0.47%。其组织病理特征是表皮角质形成细胞的过度增殖、异常分化和真皮炎症细胞的浸润,临床上表现为覆有银白色鳞屑的红色丘疹、斑块,常以头皮、背部、四肢伸侧受累多见。银屑病的发病机制尚不明确,目前普遍认为是遗传、环境和免疫因素共同作用的结果,而免疫因素中,活化的角质形成细胞和浸润的炎症细胞之间的相互作用是疾病发生发展的重要原因。针对轻中度银屑病患者以局部治疗为主,光疗、口服药物或者注射生物制剂是治疗重度患者的重要手段。树突状细胞（DCs）是一种功能强大的抗原提呈细胞,在自身免疫性疾病和免疫耐受诱导中都发挥了至关重要的作用,以往的研究表明DCs也参与了银屑病的发生与发展。DCs起源于CD34+的骨髓多功能造血干细胞,随血液分布于非淋巴组织及实质器官,并发育成为未成熟DC,在炎症介质的刺激和作用下成熟,通过淋巴管迁移至淋巴结内,分泌趋化因子和细胞因子来激活T淋巴细胞,产生特异性免疫应答。皮肤中的DCs包括LCs（朗格汉斯细胞）、p DCs（浆细胞样树突状细胞）和m DCs（髓样树突状细胞）,真皮中的DCs主要为m DCs。在银屑病样皮损中检测DCs,发现共刺激分子CD83、CD86表达增加。此外,有研究表明,银屑病皮损中受损的角质形成细胞会释放自身核苷酸,与LL-37形成LL-37-自身核苷酸复合物,刺激p DCs产生I型干扰素,导致m DCs成熟和活化。成熟的DCs能够产生IL-12和IL-23,激活和刺激Th1/Th17细胞,形成DC-T细胞簇,最终驱动T细胞的原位活化,而T细胞产生效应细胞因子,诱导角质形成细胞的增殖和异常分化是银屑病的重要特征。综上所述,探究DCs与角质形成细胞之间的相互作用,是国内外重要的研究方向。近年来,许多研究显示外泌体是细胞间通讯的重要介质,它是纳米大小（30-150nm）的囊外小泡,是内溶酶体途径的产物,可以携带和转移各种蛋白质、RNA和脂类,为许多疾病的机制研究提供了新的方向。在炎症性疾病中,越来越多的证据表明外泌体可能来自多种细胞类型,如上皮细胞、巨噬细胞、DCs和淋巴细胞等。角质形成细胞是表皮的主要成分,参与银屑病皮损的形成,还能影响表皮的微环境,并影响免疫细胞在疾病中的功能。已有研究表明,角质形成细胞能分泌外泌体通过促进中性粒细胞的活化和影响Th1/Th2极化促进银屑病的发生发展。本课题拟研究角质形成细胞来源外泌体对DCs功能的影响及其相关机制,从而为外泌体在银屑病发生发展中发挥的作用及机制研究奠定一定的基础,从而为银屑病的治疗新方向提供研究基础。本课题主要包括以下三个部分:第一部分角质形成细胞来源外泌体对树突状细胞功能的影响方法:1、使用HaCaT角质形成细胞系,细胞因子处理细胞模拟银屑病状态的角质形成细胞,使用差速离心法从两组细胞培养上清中分离纯化外泌体,并分别对外泌体进行鉴定。2、采集健康人外周血,抽提PBMC并诱导培养树突状细胞。3、将细胞因子处理和未处理的HaCaT角质形成细胞来源外泌体与部分成熟树突状细胞共孵育,测定树突状细胞表面共刺激分子表达,酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养上清中细胞因子IL-12和IL-23的表达。结果:1、分别从细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞培养上清中分离纯化提取的两组囊泡符合外泌体直径和形态特征,且两组外泌体分泌量无明显差异。2、两组外泌体分别与部分成熟的树突状细胞共孵育后,细胞因子处理组的树突状细胞表面共刺激分子表达增加,且上清中细胞因子IL-12、IL-23含量增加。第二部分角质形成细胞来源外泌体影响树突状细胞功能的机制研究方法:1、从细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体中分别提取RNA,RNA-seq和q RT-PCR技术检测并验证细胞因子处理组外泌体中高表达的miRNA分子。2、通过生物信息学网站Star Base对高表达的具体miRNA分子的下游进行预测,筛选并检索文献,选取具体分子作为miRNA的靶点进行研究。3、将细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体,与未成熟树突状细胞共孵育,通过免疫印迹法和双荧光素酶报告基因检测验证miRNA分子的作用。结果:1、提取细胞因子处理和未处理HaCaT角质形成细胞来源外泌体中的RNA进行测序,选取差异表达最显著的五条:mi R-11615、mi R-378、mi R-7054、mi R-6650、mi R-1692进行研究。q RT-PCR技术检测细胞因子处理组和未处理组HaCaT角质形成细胞、两组角质形成细胞来源外泌体、以及分别与两组外泌体共孵育的树突状细胞中这五条miRNA的表达情况,发现miRNA-378高表达且具有统计学意义。2、通过生物信息学网站Star Base对mi R-378的下游进行预测,并筛选出了其中两个以上网站支持的靶点,通过检索和阅读文献

关键词：银屑病外泌体角质形成细胞树突状细胞 microRNA miRNA-378 rora

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rora调控TGF-β1/Smad信号通路参与多发性胶质母细胞瘤的侵袭和上皮-间质转化

RORA调控TGF-β1/Smad信号通路参与多发性胶质母细胞瘤的侵袭和上...

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作者：赵君爽中国医科大学

学位级别：硕士

目的:多发性胶质母细胞瘤是一种非常罕见且难治的高级别胶质瘤亚型,患者预后极差。维甲酸相关孤核受体A（rora）作为一种转录因子,可调节靶基因的表达和功能变化,通过与其启动子发生特异性的结合。我们的前期研究表明,rora在胶质瘤中是... 详细信息

目的:多发性胶质母细胞瘤是一种非常罕见且难治的高级别胶质瘤亚型,患者预后极差。维甲酸相关孤核受体A（rora）作为一种转录因子,可调节靶基因的表达和功能变化,通过与其启动子发生特异性的结合。我们的前期研究表明,rora在胶质瘤中是低表达的,并且对胶质瘤的发生和增殖过程具有抑制作用。此外,胶质母细胞瘤（GBM）出现侵袭性增强以及肿瘤容易复发,与上皮-间质转化（EMT）的发生是密切相关的。本研究的目的是深入探讨rora对多发性胶质母细胞瘤迁移、侵袭和上皮-间质转化的调控作用及机制。方法:选取胶质母细胞瘤细胞系T98G和患者来源的胶质瘤干细胞GSC4D进行rora过表达的体外实验研究。采用q PCR、western blotting、免疫组化检测rora在临床胶质母细胞瘤组织中的表达水平。通过慢病毒转染构建rora过表达的T98G细胞和GSC4D,采用迁移试验、transwell试验、免疫荧光和western blotting检测rora对胶质母细胞瘤细胞系T98G和患者来源胶质瘤干细胞GSC4D的迁移、侵袭和上皮-间质转化的调控作用。采用基因富集分析（GSEA）、q PCR、ELISA、western blotting和荧光素酶报告实验检测rora对TGF-β1/Smad信号通路的转录调控作用。结果:q PCR、western blotting、免疫组化实验证实,rora表达水平在胶质母细胞瘤中是降低的,且多发性胶质母细胞瘤中rora的表达水平明显低于单发性胶质母细胞瘤。生存分析证实,GBM患者的预后差与rora的表达降低是有明显关系的。此外,迁移试验、transwell试验、免疫荧光和western blotting证实rora过表达抑制胶质母细胞瘤细胞系T98G和患者来源胶质瘤干细胞GSC4D的迁移、侵袭和上皮-间质转化。基因富集分析（GSEA）、q PCR、ELISA、western blotting和荧光素酶报告实验证实rora通过转录调控抑制TGF-β1的表达及其介导的Smad信号通路。结论:rora在多发性胶质母细胞瘤中表达下调,转录调控抑制TGF-β1/Smad信号通路,进一步对多发性胶质母细胞瘤的迁移、侵袭以及EMT过程产生重要的抑制作用。因此,rora可能成为分子靶向治疗胶质母细胞瘤的新的靶点。

关键词：胶质母细胞瘤 rora TGF-β1/Smad信号通路上皮-间质转化

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microRNAs协同抑制生物钟基因rora在口腔鳞癌增殖中的作用

microRNAs协同抑制生物钟基因RORA在口腔鳞癌增殖中的作用

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作者：郑雪晴武汉大学

学位级别：硕士

第一部分基于高通量测序构建口腔鳞状细胞癌中的microRNA-转录因子调控网络目的探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中,差异表达的microRNA（miRNA）和mRNA之间的调控关系,构建miRNA与转录因子之间的调控网络。材... 详细信息

第一部分基于高通量测序构建口腔鳞状细胞癌中的microRNA-转录因子调控网络目的探讨口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）中,差异表达的microRNA（miRNA）和mRNA之间的调控关系,构建miRNA与转录因子之间的调控网络。材料和方法1.应用转录组高通量测序（mRNA-seq）检测4对OSCC组织-癌旁正常上皮组织中差异表达的转录组mRNA,并对差异表达的mRNA进行功能富集分析。2.应用小RNA高通量测序（miRNA-seq）检测4对OSCC组织-癌旁正常上皮组织中差异表达的miRNA。3.构建OSCC组织中差异表达的miRNA和mRNA间的负向变化关系对,应用miRanda和Target Scan软件预测差异表达miRNA的潜在靶基因,并进一步筛选每对组织中负向变化的miRNA-预测靶向mRNA对（上调miRNA-下调靶向mRNA/下调miRNA-上调靶向mRNA）。4.将负向变化的miRNA-预测靶向mRNA对中上调的mRNA和下调的mRNA进行功能富集分析,研究OSCC中差异表达的miRNA和mRNA之间的功能关系及对OSCC产生的影响。结果1.MRNA-seq结果显示,在8个OSCC或癌旁正常组织样本中,每个样本检测到的转录组mRNA的表达数为21977-24584个。每对OSCC-癌旁正常组织中分析出3042-6776个差异表达mRNA。与癌旁正常组织相比,4对OSCC组织中有183个mRNA共同上调、185个mRNA共同下调。上调mRNA主要富集于肿瘤增殖、侵袭相关的信号通路,如有丝分裂、纺锤体构成等;下调mRNA主要富集于正常上皮生物功能相关的信号通路,如角质细胞分化、转录调控、细胞凋亡等。2.MiRNA-seq结果显示,有1034-2067个miRNA在8个OSCC或癌旁正常组织样本中表达。每对OSCC-癌旁正常组织中分析出120-268个差异表达miRNA。4对OSCC-癌旁正常组织中有17个miRNA共同上调、1个miRNA共同下调。3.MiRanda和Target Scan软件预测结果显示,2617个差异表达miRNA预测有16968个靶基因。其中,我们总共识别了8137个负向变化的miRNA-靶向mRNA对,涉及到213个差异表达miRNA和2172个差异表达mRNA。4.功能富集分析结果显示,4对OSCC-癌旁正常组织的负靶向对中,下调mRNA均主要富集于转录相关信号通路;上调mRNA富集于细胞增殖、细胞迁移、血管生成等信号通路,不同组织间存在个体差异,无明显规律性。我们选择上调的133个miRNA-下调的168个转录因子的负调控关系构建了OSCC的miRNA-转录因子调控网络图。结论OSCC中差异上调的miRNA主要通过下调转录因子来调控转录相关信号通路,以影响肿瘤发生进程;从而构建了OSCC中的miRNA-转录因子调控网络。第二部分口腔鳞状细胞癌中microRNA协同抑制生物钟基因rora的表达目的探讨在口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）的microRNA（miRNA）-转录因子调控网络中,5个预测靶向维甲酸孤核受体A（Retinoic acid receptor-related orphan receptor,rora）的miRNA对其协同抑制作用。材料和方法1.在OSCC的miRNA-转录因子调控网络里选取的miRNA-rora子网中,根据人类细胞miRNA测序数据,将预测靶向rora的25个miRNA进一步筛选相应的miRNA进行后续研究。2.通过q PCR反应检测44对OSCC-正常组织中rora的mRNA表达水平和38对OSCC-正常组织中预测靶向rora的5个miRNA（miR-503-5p、miR-450b-5p、miR-27a-3p、miR-181a-5p和miR-183-5p）的表达水平。3.利用p Si CheckTM-2双荧光素酶载体构建插入了rora 3’UTR（包含5个miRNA结合位点）的载体p Si CheckTM-2-rora 3’UTR。应用双荧光素酶实验验证5个miRNA对rora的直接靶向抑制作用。4.将5个miRNA的inhibitor单个、两两或者五个一起转入Hela细胞中。利用q PCR检测各组细胞内rora的mRNA水平,检测5个miRNA对rora的协同抑制作用。结果1.OSCC的miRNA-转录因子调控网络的下调转录因子中包含了多达4个生物钟基因（rora、RORB、RORC和CLOCK）,并被多个miRNA同时靶向调控。其中rora被报道在许多肿瘤中表达下调,能通过抑制增殖发挥抑癌作用,遂选择miRNA-rora子网进行研究。靶向rora的25个miRNA在人类细胞miRNA测序数据中显示,其中8个miRNA可能与巨噬细胞浸润相关。去

关键词：口腔鳞状细胞癌高通量测序 microRNA-转录因子调控网 microRNA 协同作用 rora 生物钟基因头颈鳞状细胞癌细胞增殖

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宫颈癌组织中MicroRNA-1246调控rora和NF-κB表达的相关临床研究

宫颈癌组织中MicroRNA-1246调控RORA和NF-κB表达的相关临床研究

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作者：杨帆昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]子宫颈癌是女性生殖器中最常见的恶性肿瘤,对女性健康产生严重影响,高危型乳头病毒（HR-HPV）的持续感染是子宫颈癌发生的主要原因。宫颈癌的发生、发展是多因素参与、多阶段控制的复杂过程。小分子内源性非编码RNA（microRNA、mi... 详细信息

[目的]子宫颈癌是女性生殖器中最常见的恶性肿瘤,对女性健康产生严重影响,高危型乳头病毒（HR-HPV）的持续感染是子宫颈癌发生的主要原因。宫颈癌的发生、发展是多因素参与、多阶段控制的复杂过程。小分子内源性非编码RNA（microRNA、miRNA）调控蛋白质编码基因的转录后的翻译过程。microRNAs在癌症发生和发展中起着重要作用,被用作癌症诊断、潜在治疗靶点和预后评价的分子标志物。本研究收集了临床子宫颈组织样本,采用RT-PCR方法对人体子宫颈组织中的microRNA-1246、rora、NF-κ B.的表达情况进行检测,分析其与临床资料的关系,初步探索三者在子宫颈癌发生和发展中的作用。其目的在于为进一步研究miR-1246在子宫颈癌中是否通过rora调节NF-κ B信号通路提供研究的基础。[方法]1、收集2020年1月至2020年8月在云南大学附属医院妇科接受初期治疗的宫颈癌患者的宫颈癌组织52例以及因子宫肌瘤、子宫腺肌病、子宫脱垂等良性病变接受手术治疗的患者的正常宫颈组织25例,进行RNA提取及逆转录。2、通过 Target Scan 7.2,TarBase v8.8,miRBase 和 miRWalk 数据库中将 miR-1426的下游目标基因rora筛选出来;3、用RT-RCR方法检查宫颈癌组织及正常宫颈组织中的miR-1246、rora、NF-κB的表达水平,并分析其与年龄、FIGO的分期、肿瘤的大小、淋巴结的转移等临床病理学指标之间的关系。[结果]1、miR-1246在全期别52例宫颈癌组织中相对表达量为1.64±0.23,25例正常宫颈组织的相对表达量为1.00±0.16,宫颈癌组织中的miR-1246的相对表达量明显高于正常宫颈组织（P＜0.05）。miR-1246的表达量在Ⅰ、Ⅱ期子宫颈癌组织中低于正常子宫颈组织,Ⅲ、Ⅳ期表达量则高于正常子宫颈组织（P＜0.05）。2、rora在全期别52例宫颈癌组织中的相对表达量为0.41±0.09,25例正常宫颈组织的相对表达量为1.00±0.23,rora在宫颈癌组织中的相对表达量明显低于正常的宫颈组织（P＜0.05）。rora的表达量在Ⅰ、Ⅱ期宫颈癌组织中高于正常宫颈组织,在Ⅲ、Ⅳ期中低于正常宫颈组织（P＜0.05）。3、NF-κB在全期别52例宫颈癌组织中的相对表达量为1.54±0.33。25例正常宫颈组织的相对表达量为1.00±0.17,宫颈癌组织中的NF-κ B的相对表达量明显高于正常的宫颈组织（P＜0.05）。NF-κB的表达量在Ⅰ期子宫颈癌组织中低于正常子宫颈组织,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ表达量高于正常子宫颈组织（P＜0.05）。4、在宫颈癌组织中,miR-1246与rora的表达负向相关,相关系数r值为-0.517（P＜0.01）。miR-1426和NF-κB的表达正向相关,相关系数r值为0.975（P＜0.01）。rora和NF-κB的表现没有明显的关联。5、miR-1246、rora、NF-κB的表达量与子宫颈癌FIGO分期相关,miR-1246、NF-κB的表达量随分期进展逐渐上升（P＜0.05）。rora随着FIGO分期的上升,表现量逐渐下降（P＜0.05）。miR-1246,rora,NF-κB的表达量与患者的年龄、肿瘤大小、病理类型、淋巴结转移均无关（P＞0.05）。[结论]1、miR-1246在所有期别的宫颈癌组织中表达量高于正常宫颈组织,其中在Ⅲ、Ⅳ期的表达量高于Ⅰ、Ⅱ期。rora在所有期别的宫颈癌组织中表达量低于正常宫颈组织,其中在Ⅲ、Ⅳ期的表达量低于Ⅰ、Ⅱ期。NF-κB在所有期别的宫颈癌组织中的表达量高于正常宫颈组织,其中在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期宫颈癌组织中表达量高于Ⅰ期。2、miR-1246与rora表达呈负相关,miR-1246与NF-κ B的表达呈正相关。3、miR-1246、rora、NF-κB的表达量与宫颈癌FIGO分期有关,与患者的年龄、肿瘤的大小、病理类型、淋巴结的转移无关。

关键词：宫颈癌 miR-1246 rora NF-κB RT-PCR

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夜光暴露及rora、PER2基因多态性与钢铁工人空腹血糖升高的相关性研究

夜光暴露及RORA、PER2基因多态性与钢铁工人空腹血糖升高的相关性...

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作者：杨荔华北理工大学

学位级别：硕士

目的探讨夜光暴露与rora、PER2基因多态性及其交互作用对钢铁工人空腹血糖升高的影响,为早期干预提供依据。方法本研究以京津冀职业人群健康状况队列研究的基线调查为基础,以唐山钢铁公司参加2017年职业健康体检的7034名在岗工人为研究... 详细信息

目的探讨夜光暴露与rora、PER2基因多态性及其交互作用对钢铁工人空腹血糖升高的影响,为早期干预提供依据。方法本研究以京津冀职业人群健康状况队列研究的基线调查为基础,以唐山钢铁公司参加2017年职业健康体检的7034名在岗工人为研究对象,通过问卷调查和体格检查收集相关数据信息,利用限制性立方样条模型分析工作中夜光暴露与空腹血糖升高之间的相关性,利用多因素Logistic回归模型分析与钢铁工人空腹血糖升高相关的影响因素,并进行不同因素的交互作用分析。结合研究对象的纳入排除标准,使用SPSS从数据信息完整的7034人中随机选取366名男性空腹血糖升高人群和366名男性空腹血糖正常对照,提取病例对照人群DNA,通过聚合酶链式反应扩增目的基因片段,扩增产物经限制性内切酶消化切割后进行琼脂糖凝胶电泳,并分辨相应的基因型。运用Logistic回归分析基因与基因、基因与环境之间的交互作用对空腹血糖升高的影响。结果1本研究人群空腹血糖水平升高检出率为62.0%（4360/7034）,其中男性检出率63.3%（4080/6442）,女性检出率47.3%（280/592）;2利用限制性立方样条分析工作中夜光暴露与钢铁工人空腹血糖升高之间的相关性,调整年龄、性别、教育水平、婚姻状况、家庭人均月收入、吸烟、饮酒、饮食模式、食盐量、睡眠时间、静坐时间、体力活动、BMI、高血压、血脂异常、糖尿病家族史、睡眠时拉窗帘、开灯睡眠、卧室明亮程度、睡眠时窗外发光物体、睡眠时开灯次数、高温暴露、噪声暴露、粉尘暴露、CO暴露、倒班情况,发现工作中夜光暴露与空腹血糖升高之间存在线性剂量反应关系（整体关联性检验χ2=8.80,P=0.012;非线性检验χ2=3.35,P=0.067）;3多因素Logistic回归分析结果显示工作中夜光暴露和睡眠时夜光暴露是空腹血糖升高的危险因素;工作中夜光暴露≥4304h与参照组相比空腹血糖升高的危险增加20.1%（OR=1.201,95%CI:1.001～1.441）;睡眠时夜光暴露结果显示:睡眠时卧室明亮程度偏暗与最暗相比,空腹血糖升高的危险增加17.6%（OR=1.176,95%CI:1.048～1.321）;4 rora基因rs8034880位点多态性与空腹血糖升高相关,其中隐性模型（AA,AG vs GG）有统计学意义（OR=1.48,95%CI:1.01～2.16）;未发现PER2基因rs2304672位点基因多态性与空腹血糖升高之间存在关联;5未发现rora基因rs8034880位点与和PER2基因rs2304672位点之间存在相乘模型交互作用;6 rora基因rs8034880位点基因多态性与工作中夜光暴露和卧室明亮程度存在交互作用,携带GG基因可增加短期夜光暴露者（OR=2.123,95%CI:1.087～4.144）和卧室明亮程度最暗者（OR=2.048,95%CI:1.048～4.004）空腹血糖升高风险;7 PER2基因rs2304672位点基因多态性与工作中夜光暴露之间发现存在交互作用,携带GG基因可降低短期夜光暴露者（OR=0.495,95%CI:0.264～0.927）空腹血糖升高风险,但未发现该位点与卧室明亮程度存在交互作用。结论1工作中夜光暴露、睡眠时夜光暴露是钢铁工人空腹血糖升高危险因素;2 rora基因rs8034880位点基因多态性与男性钢铁工人空腹血糖升高相关;3未发现PER2基因rs2304672位点基因多态性与钢铁工人空腹血糖升高相关;4未发现rora基因rs8034880位点与PER2基因rs2304672位点之间存在交互作用;5 rora基因rs8034880位点与工作中夜光暴露和卧室明亮程度存在交互作用;PER2基因rs2304672位点基因多态性与工作中夜光暴露存在交互作用。图8幅;表23个;参97篇。

关键词：空腹血糖夜光暴露 rora PER2 单核苷酸多态性

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miR-378a对骨骼肌肌纤维类型及其代谢的调控机理

miR-378a对骨骼肌肌纤维类型及其代谢的调控机理

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作者：化朝举中国农业科学院

学位级别：硕士

MicroRNA是一类长度22nt左右的单链非编码RNA,通过对microRNA调控机制模型研究表明其种子序列的2～4bp碱基可在AGO2蛋白的协助下随机结合到mRNA的3’-UTR区沿3’-5’方向前移,直至找到与其种子序列(2～8bp碱基)完全互补的序列便停止前进... 详细信息

MicroRNA是一类长度22nt左右的单链非编码RNA,通过对microRNA调控机制模型研究表明其种子序列的2～4bp碱基可在AGO2蛋白的协助下随机结合到mRNA的3’-UTR区沿3’-5’方向前移,直至找到与其种子序列(2～8bp碱基)完全互补的序列便停止前进,与mRNA 3’-UTR稳定结合抑制mRNA的蛋白翻译。MicorRNA高通量测序数据表明在小鼠体内四条不同的染色体上,分别存在着编码mmu-miR-378a/b/c/d的四个microRNA基因座,这四个基因座转录形成的成熟microRNA序列长度20-22bp不等,两两之间有1-2个碱基的差异变化,但他们有完全一样的种子序列,因此推测他们发挥类似的基因调控作用。在miRbase数据库中小鼠的mmu-miR-378a的表达量最高,其位于18号染色体上,峰值达到4.48M reads。目前对miR-378a基因功能研究主要集中在脂肪代谢、癌症迁移及发展、卵泡的成熟和细胞分化等方面,虽然众多数据显示miR-378a在骨骼肌中高表达,然而尚未有足够的实验数据说明miR-378a在骨骼肌中高表达的意义所在。本实验旨在探索miR-378a在骨骼肌肌纤维类型组成及其在糖代谢中的功能,以解释miR-378a在骨骼肌中高表达的意义。为探究miR-378a在骨骼肌中的功能,本研究制备了miR-378a敲除小鼠,并分析了骨骼肌的表型和调控机制。采集miR-378a敲除小鼠和野生小鼠的股四头肌(Qua),通过ATPase染色和检测肌纤维相关类型相关基因myh1和myh2的表达分析,表明miR-378a影响小鼠肌纤维类型组成;为探究miR-378a对骨骼肌代谢的影响,本研究分析了miR-378a敲除小鼠和野生小鼠的血清生化指标,并通过生物信息学和实验生物学方法,发现miR-378a通过锚定rora调控骨骼肌纤维类型转化和糖代谢。本研究主要获得以下结果:(1)小鼠mmu-miR-378a在骨骼肌中的表达量较高;且在分离的小鼠腓肠肌(Gas)、比目鱼肌(SOL)、胫骨前肌(TA)、趾长伸肌(EDL)和股四头肌(Qua)中发现富含酵解型肌纤维的Gas、EDL和Qua组织中miR-378a的表达量最为丰富。(2)通过miR-378a敲除和野生小鼠的Qua及Gas组织进行碱性ATPase酶染色发现miR-378a敲除组小鼠的Qua和Gas组织中氧化型纤维所占面积百分比增加,其中Qua组织中增加量极显著(p=0.002),而Gas组织中氧化型纤维亦有所增加但不显著(p=0.136);(3)通过对miR-378a敲除小鼠和野生小鼠血清中生化指标检测结果表明:miR-378a敲除组血清中与骨骼肌葡萄糖酵解相关的乳酸脱氢酶(LDH)以及与底物磷酸化生成ATP相关的肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的含量上升。(4)通过microRNA靶标调取实验找到miR-378a的靶基因rora,并用双萤光素酶活性实验证实了miR-378a对rora的靶标作用。(5)通过在C2C12上过表达rora,验证了miR-378a敲除对小鼠Qua组织中LDH和CK的表达量影响是通过其靶基因rora进行调控的。结论:rora是miR-378a的一个靶标,miR-378a可通过其调控骨骼肌肌纤维类型和糖代谢。

关键词：骨骼肌代谢 miR-378a 肌纤维类型 rora

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rora基因多态性与儿童哮喘的关联研究

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临床肺科杂志 2018年第12期23卷 2211-2214页

作者：高伟霞秦小菀张靖刘阳丁显春南阳市中心医院儿科急诊河南南阳473000 南阳市中心医院新生儿科河南南阳473000 南阳市中心医院儿科一病区河南南阳473000 南阳市中心医院儿科三病区河南南阳473000

目的探究rora rs11071559和rs7164773单核苷酸多态性与儿童哮喘发生的关系。方法应用聚合酶链反应检测rora rs11071559和rs7164773基因多态性,比较哮喘患儿组与健康儿童rora rs11071559和rs7164773基因型的分布频率差异以及等位基因频... 详细信息

目的探究rora rs11071559和rs7164773单核苷酸多态性与儿童哮喘发生的关系。方法应用聚合酶链反应检测rora rs11071559和rs7164773基因多态性,比较哮喘患儿组与健康儿童rora rs11071559和rs7164773基因型的分布频率差异以及等位基因频率差异。结果 100例哮喘患儿组和100例健康儿童对照组。rora rs11071559基因型分布频率野生型CC为52/68%,杂合型CT为28/24%,突变型TT为20/8%,两组比较χ~2=7. 06,P=0. 029,等位基因频率野生型C为65/76%,突变型T为35/24%,两组比较χ~2=5. 36,P=0. 024; rora rs7164773基因型分布频率野生型CC为48/60%,杂合型CT为26/22%,突变型TT为26/18%,两组比较χ~2=8. 01,P=0. 021,等位基因频率野生型C为59/68%,突变型T为59/32%,两组比较χ~2=6. 24,P=0. 017。结论哮喘患儿组与健康儿童对照组rora rs11071559和rs7164773基因型分布频率和等位基因频率有显著差异,提示哮喘的发生可能与rora rs11071559和rs7164773基因型多态性具有某种关联。

关键词： rora 哮喘基因多态性

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