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Sodium butyrate alleviates deoxynivalenol-induced hepatic cholesterol metabolic dysfunction via rorγ-mediated histone acetylation modification in weaning piglets

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Journal of Animal Science and Biotechnology 2023年第2期14卷 792-805页

作者： Qiufang Zong Huan Qu Yahui Zhao Haoyu Liu Shenglong Wu Shuai Wang Wenbin Bao Demin Cai College of Animal Science and Technology Yangzhou UniversityYangzhou 225009PR China Joint International Research Laboratory of Agriculture&Agri‑Product Safety Yangzhou UniversityYangzhou 225009PR China Department of Animal Nutrition and Feed Science College of Animal Science and TechnologyHuazhong Agricultural UniversityWuhan 430070PR China.

Background:Cholesterol is an essential component of lipid rafts in cell plasma membrane,which exerts a hepatoprotective role against mycotoxin exposure in pigs,and cholesterol metabolism is vulnerable to epigenetic histone acetylation.Therefore,our present study aimed to investigate whether a histone deacetylase inhibitor(sodium butyrate [NaBu]) could protect the porcine liver from deoxynivalenol(DON) exposure by modulating cholesterol metabolism.Herein,we randomly divided 28 pigs into four groups,which were fed an uncontaminated basal diet,contaminated diet(4 mg DON/kg),uncontaminated diet supplemented with 0.2% NaBu or 4 mg/kg DON contaminated diet(4 mg DON/kg) supplemented with 0.2% NaBu for 28 d.Results:We found that the serum alanine transaminase(ALT),aspartate transaminase(AST),and alkaline phosphatase(ALP) were all increased in pigs exposed to DON,indicative of significant liver injury.Furthermore,the cholesterol content in the serum of DON-exposed pigs was significantly reduced,compared to the healthy Vehicle group.Transcriptome analysis of porcine liver tissues revealed that the cholesterol homeostasis pathway was highly enriched due to DON exposure.In which we validated by qRT-PCR and western blotting that the cholesterol program was markedly activated.Importantly,NaBu effectively restored parameters associated with liver injury,along with the cholesterol content and the expression of key genes involved in the cholesterol biosynthesis pathway.Mechanistically,we performed a ChIP-seq analysis of H3K27ac and showed that NaBu strongly diminished DON-increased H3K27ac genome-wide enrichment.We further validated that the elevated H3K27ac and H3K9ac occupancies on cholesterol biosynthesis genes were both decreased by NaBu,as determined by ChIP-qPCR analysis.Notably,nuclear receptor rorγ,a novel regulator of cholesterol biosynthesis,was found in the hyperacetylated regions.Again,a remarkable increase of rorγ at both mRNA and protein levels in DON-exposed porcine livers was drastically reduced by NaBu.Consistent

关键词： Cholesterol biosynthesis DON Histone acetylation rorγ Sodium butyrate

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Targeting castration-resistant prostate cancer with a novel rorγ antagonist elaiophylin

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Acta Pharmaceutica Sinica B 2020年第12期10卷 2313-2322页

作者： Jianwei Zheng Junfeng Wang Qian Wang Hongye Zou Hong Wang Zhenhua Zhang Jianghe Chen Qianqian Wang Panxia Wang Yueshan Zhao Jing Lu Xiaolei Zhang Songtao Xiang Haibin Wang Jinping Lei Hong-Wu Chen Peiqing Liu Yonghong Liu Fanghai Han Junjian Wang School of Pharmaceutical Sciences Sun Yat-sen UniversityGuangzhou 510006China CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology/Guangdong Key Laboratory of Marine Materia Medica South China Sea Institute of OceanologyChinese Academy of SciencesGuangzhou 510301China Department of Biochemistry and Molecular Medicine UC Davis Comprehensive Cancer CenterSchool of MedicineUniversity of CaliforniaDavisSacramentoCA 95817USA Department of Urology the Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese MedicineGuangzhou 510120China Department of Joint Orthopaedic the First Affiliated HospitalGuangzhou University of Chinese MedicineGuangzhou 510405China National-Local Joint Engineering Laboratory of Druggability and New Drugs Evaluation Sun Yat-sen UniversityGuangzhou 510006China Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Design and Evaluation School of Pharmaceutical SciencesSun Yat-sen UniversityGuangzhou 510006China Department of Gastrointestinal Surgery Sun Yat-sen Memorial HospitalSun Yat-sen UniversityGuangzhou 510120China

Prostate cancer(PCa)patients who progress to metastatic castration-resistant PCa(mCRPC)mostly have poor outcomes due to the lack of effective therapies.Our recent study established the orphan nuclear receptor rorγas a novel therapeutic target for CRPC.Here,we reveal that elaiophylin(Elai),an antibiotic from Actinomycete streptomyces,is a novel rory antagonist and showed potent antitumor activity against CRPC in vitro and in vivo.We demonstrated that Elai selectively binded to rory protein and potently blocked rorγtranscriptional regulation activities.Structure-activity relationship studies showed that Elai occupied the binding pocket with several key interactions.Furthermore,Elai markedly reduced the recruitment of rorγto its genomic DNA response element(rorE),suppressed the expression of rorγtarget genes AR and AR variants,and significantly inhibited PCa cell growth.Importantly,Elai strongly suppressed tumor growth in both cell line based and patient-derived PCa xenograft models.Taken together,these results suggest that Elai is novel therapeutic rorγinhibitor that can be used as a drug candidate for the treatment of human CRPC.

关键词： rorγ Castration-resistant prostate cancer Nuclear receptor Antagonist Elaiophylin

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Time-restricted feeding downregulates cholesterol biosynthesis program via rorγ-mediated chromatin modification in porcine liver organoids

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Journal of Animal Science and Biotechnology 2021年第1期12卷 402-414页

作者： Kexin Zhang Hao Li Zimeng Xin Yanwei Li Xiaolong Wang Yun Hu Haoyu Liu Demin Cai College of Animal Science and Technology Yangzhou UniversityYangzhou 225009PR China Institute of Epigenetics and Epigenomics Yangzhou UniversityYangzhou 225009PR China

Background: Time-restricted feeding(TRF) is a dieting strategy based on nutrients availability and diurnal rhythm,shown to improve lipid metabolism efficiency. We have demonstrated previously that retinoic acid-related(RAR)orphan receptor(ror) γ is the primary transcription factor controlling cholesterol(CHO) biosynthesis program of animals. However, the functional role of rorγ in liver physiology of pigs in response to TRF has not been determined, largely due to the lack of functional models and molecular tools. In the present study, we established porcine liver organoids and subjected them to restricted nutrients supply for 10-h during the light portion of the day.Results: Our results showed that TRF regimen did not alter hepatocyte physiology, including unchanged cell viability, caspase 3/7 enzyme activity and the gene signature of cell proliferation in porcine liver organoids,compared to the control group(P > 0.05). Furthermore, we found that TRF downregulated the hepatic CHO biosynthesis program at both mRNA and protein levels, along with the reduced cellular CHO content in porcine liver organoids(P rorγ as the predominant transcription factor that responded to TRF, amongst the 12 targeted nuclear receptors(NRs)(P rorγ direct binding to the MVK gene(encoding mevalonate kinase). Finally, we showed that rorγ agonists and overexpression enhanced the enrichment of cofactor p300, histone marks H3 K27 ac and H3K4me1/2, as well as RNA polymerase II(Pol-II) at the locus of MVK, in TRF-porcine liver organoids, compared to TRF-vector control(P rorγ-mediated chromatin remodeling at the locus of CHO biosynthesis genes in porcine liver organoids and further improves lipid metabolism.

关键词： Cholesterol biosynthesis program Histone modification Pig Porcine liver organoids rorγ Time-restricted feeding

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猪流行性腹泻病毒对仔猪肝脏脂质过氧化与胆固醇代谢的影响及其调控机制

猪流行性腹泻病毒对仔猪肝脏脂质过氧化与胆固醇代谢的影响及其调...

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作者：顾昊天扬州大学

学位级别：硕士

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于甲型冠状病毒,感染仔猪会出现急性腹泻和严重脱水的临床症状,发病率和死亡率居高不下。感染PEDV会抑制仔猪肠道屏障的功能,目前已有研究发现,肠道、肝脏和血液代谢物之间存在相互作用,并将这种相互作用称为... 详细信息

猪流行性腹泻病毒(PEDV)属于甲型冠状病毒,感染仔猪会出现急性腹泻和严重脱水的临床症状,发病率和死亡率居高不下。感染PEDV会抑制仔猪肠道屏障的功能,目前已有研究发现,肠道、肝脏和血液代谢物之间存在相互作用,并将这种相互作用称为“肠肝轴”作用。生物体需要借助肝脏清除由肠道进入血液的外界抗原、细菌和内毒素,避免导致严重的机体损伤。肝脏中线粒体含量丰富,而线粒体是产生活性氧(ROS)的主要场所,导致肝脏比其他器官更易受到ROS的攻击,发生氧化应激,同时促进脂质过氧化物的积累。脂质过氧化物是细胞增殖和死亡的关键介质,因此需要阐明内源性脂质过氧化物代谢在猪流行性腹泻病毒感染中的作用和调控机制。本研究表明,PEDV感染仔猪肝脏中抗氧化酶SOD、CAT、线粒体复合物Ⅰ、线粒体复合物Ⅲ和线粒体复合物V的酶活性以及线粒体ATP和抗氧化剂还原型谷胱甘肽的含量均显著降低。相反,肝脏中脂质过氧化生物标志物丙二醛和ROS的含量显著升高。此外,通过转录组分析,我们发现PEDV感染抑制了过氧化物酶体代谢通路,并利用qRT-PCR和免疫印迹法进一步验证GPX4、CAT、SOD1、SOD2、GCLC、SLC7A11等抗氧化基因表达的下调。甲羟戊酸(MVA)通路对脂质过氧化代谢至关重要,而核受体rorγ是MVA的调节因子,通过ChIP-seq和ChIP-qPCR分析,我们发现rorγ可以直接与抗氧化关键基因结合,而PEDV感染强烈抑制了结合强度。组蛋白活性标记如H3K9/27ac和H3K4mel/2,以及活性辅因子p300和聚合酶Ⅱ在这些基因位点的结合显著减少。重要的是,通过ChIP-re-ChIP分析发现,PEDV感染抑制了 rorγ和脂质过氧化的主要调节因子NRF2之间的相互作用,促进了转录水平上抗氧化基因表达的下调。鉴于MVA通路还参与胆固醇的生物合成,而体外冠状病毒感染需要胆固醇,因此需要阐明内源性胆固醇代谢在调节猪流行性腹泻病毒感染中的作用及机制。在本研究中,与对照组相比,PEDV感染仔猪肝脏中的胆固醇和胆汁酸含量均显著升高,一致地,参与胆固醇代谢的关键基因的表达显著上调。转录组分析表明,胆固醇稳态通路是PEDV感染仔猪肝脏中富集最显著的通路之一。出乎意料的是,胆固醇代谢途径中关键基因的表达在mRNA水平下调,在蛋白水平却上调。PEDV感染后,胆固醇代谢的主要转录因子包括SREBP2和FXR在mRNA和蛋白水平均上调。进一步的ChIP-qPCR分析表明,PEDV感染显著抑制了这些转录因子与胆固醇代谢途径关键基因位点的结合。还观察到,在PEDV感染仔猪肝脏中,胆固醇代谢基因HMGCR和HMGCS1基因位点上的组蛋白活性标记H3K27ac和H3K4me1的结合显著减少。综上所述,rorγ通过与NRF2以及组蛋白修饰相互作用,可能是调节PEDV感染仔猪肝脏抗氧化基因表达的潜在因素。同时,PEDV通过表观遗传抑制SREBP2/FXR介导的转录,导致胆固醇代谢基因的异常调节,这为对抗PEDV提供了潜在的抗病毒靶点。

关键词：猪流行性腹泻氧化应激脂质过氧化胆固醇 rorγ

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紫檀芪改善短期睡眠限制小鼠肝脏糖脂代谢和昼夜节律紊乱的作用及机制研究

紫檀芪改善短期睡眠限制小鼠肝脏糖脂代谢和昼夜节律紊乱的作用及...

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中国营养学会第十五届全国营养科学大会

作者：张钧常梦云张乾勇陈卡糜漫天陆军军医大学营养与食品安全研究中心重庆市营养与食品安全重点实验室

目的明确紫檀芪(Pterostilbene,PTE)对短期睡眠限制(Sleep restriction,SR)小鼠肝脏糖脂代谢状态和代谢节律的影响,并从紫檀芪影响生物钟反馈通路rorγ/NR1D1-BMAL1探讨其具体分子机制。方法 C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(CON组)、... 详细信息

目的明确紫檀芪(Pterostilbene,PTE)对短期睡眠限制(Sleep restriction,SR)小鼠肝脏糖脂代谢状态和代谢节律的影响,并从紫檀芪影响生物钟反馈通路rorγ/NR1D1-BMAL1探讨其具体分子机制。方法 C57BL/6J雄性小鼠随机分为对照组(CON组)、短期睡眠限制组(SR组)及短期睡眠限制加紫檀芪组(SR+PTE组)。利用新型睡眠剥夺仪构建SR小鼠模型,睡眠限制20h/d,SR+PTE组小鼠给予紫檀芪(100mg/kg·d·bw)灌胃,其余小鼠生理盐水灌胃,持续5d。每日测量小鼠体重变化及饲料消耗情况,建模结束后做口服糖耐量实验、胰岛素耐量实验,分别于ZT0-ZT24多个时间点收集小鼠血清及肝脏,检测血清血脂、胰岛素、瘦素含量,Realtime-PCR法、Western Blotting法分别检测肝脏组织部分生物钟基因、糖脂代谢基因、胰岛素通路基因转录或翻译水平,并分析昼夜节律。在前述实验基础上,采用萤光素酶报告基因法分析小鼠活体肝脏PTE对rorγ或NR1D1介导的baml1基因启动子rorE区域的转录活性的影响。C57BL/6J雄性小鼠通过尾静脉注射肝脏特异性rorγ过表达腺病毒质粒(Ad-rorγ)和BMAL1萤光素酶过表达腺病毒质粒(Ad-BMAL1-Luc),或NR1D1过表达腺病毒质粒(Ad-NR1D1)和Ad-BMAL1-Luc,按照前述方法建模后,利用小动物活体成像仪连续观察ZT0-ZT24多个时间点小鼠活体肝脏BMAL1-Luc活性变化。结果 PTE可改善SR小鼠平均体重、进食量下降,降低血清血脂、血糖及胰岛素水平,并提高肝脏糖脂代谢基因pdk4、srebf2 mRNA转录水平和GSK3β、LXRα、PPARα、PGC1蛋白表达丰度,维持生物钟基因clock、bmal1、rora、rorc m RNA转录和蛋白表达昼夜节律振荡(prorγ小鼠肝脏BMAL1-Luc活性变化及昼夜节律(prorγ/BMAL1有关。

关键词：紫檀芪睡眠限制糖脂代谢 rorγ BMAL1

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益气温阳护卫汤对哮喘大鼠Th17/Treg细胞失衡与rorγ、Foxp3的影响

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中华中医药杂志 2021年第5期36卷 2635-2640页

作者：余涛丁明喻强强余建玮叶超孙朋薛汉荣江西中医药大学临床医学院南昌330004 江西中医药大学岐黄国医书院南昌330025 江西中医药大学附属医院南昌330006 江西中医药大学附属医院呼吸与危重症医学科南昌330006

目的:研究益气温阳护卫汤对哮喘大鼠Th17/Treg细胞失衡与rorγ、Foxp3的影响。方法:将144只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组,模型组,益气温阳护卫汤低、中、高剂量组及地塞米松组,卵蛋白氢氧化铝溶液致敏,雾化吸入卵蛋白激发建立哮喘大... 详细信息

目的:研究益气温阳护卫汤对哮喘大鼠Th17/Treg细胞失衡与rorγ、Foxp3的影响。方法:将144只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组,模型组,益气温阳护卫汤低、中、高剂量组及地塞米松组,卵蛋白氢氧化铝溶液致敏,雾化吸入卵蛋白激发建立哮喘大鼠模型,分别于激发1、2、4周末各组处死大鼠8只,检测肺组织中Th17、Treg细胞比例及rorγ、Foxp3 mRNA及蛋白表达。结果:与对照组同期比较,模型组Th17细胞比例显著升高(ProrγmRNA及蛋白表达显著升高(ProrγmRNA及蛋白相对表达量均显著降低(Prorγ、Foxp3的表达相关。

关键词：支气管哮喘益气温阳护卫汤 Th17/Treg细胞失衡 rorγ Foxp3 洪广祥呼吸系统疾病

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HepG2细胞中rorγ相互作用蛋白的筛选及鉴定

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免疫学杂志 2012年第5期28卷 374-377,381页

作者：吴水英丁玲桃黄泽民湖北省罗田县人民医院检验科 438600 重庆市第三军医大学全军免疫学研究所 400038

目的筛选HepG2细胞中转录因子rorγ(the retinoid-related orphan nuclear receptor gamma)相互作用蛋白,并对这些蛋白进行初步鉴定,为阐述rorγ介导调节HepG2细胞中各种生理学进程提供理论依据。方法从HepG2细胞中克隆rorγ基因并连接... 详细信息

目的筛选HepG2细胞中转录因子rorγ(the retinoid-related orphan nuclear receptor gamma)相互作用蛋白,并对这些蛋白进行初步鉴定,为阐述rorγ介导调节HepG2细胞中各种生理学进程提供理论依据。方法从HepG2细胞中克隆rorγ基因并连接入载体pCeMM CTAP(SG)中形成rorγ-CTAP(SG)融合基因,再将其亚克隆入含嘌呤霉素抗性基因的载体质粒中,构建pMSCVpuro rorγ-CTAP(SG)质粒;稳定转染HepG2细胞并对rorγ-CTAP(SG)融合基因的表达和定位进行检测后,进行大规模扩增培养;用TAP(串联亲和纯化)方法捕获rorγ相互作用蛋白,通过银染找出差异性蛋白条带,质谱鉴定得到候选rorγ相互作用蛋白;用免疫共沉淀方法对候选蛋白rorγ相互作用蛋白进行验证鉴定。结果成功构建了质粒pMSCVpuro rorγ-CTAP(SG)并得到稳定转染HepG2细胞株,同时rorγ-CTAP(SG)融合基因能定位表达于细胞核内;通过TAP方法获得了rorγ蛋白复合物,然后通过串联质谱分析和数据库搜索从银染差异性显著蛋白条带中找到7个候选rorγ相互作用蛋白;用rorγ蛋白进行免疫共沉淀,对纯化出的7个rorγ相互作用蛋白分别检测,证实了RIP140,HSP90和rorγ在HepG2中有相互作用关系。结论筛选并鉴定了HepG2细胞中蛋白rorγ的相互作用蛋白RIP140和HSP90,这些研究发现支持了rorγ是共调解蛋白依赖的转录因子且以复合物形式行使功能的假说。其中,HSP90可能扮演分子伴侣角色,而RIP140在HepG2细胞中则可能充当rorγ蛋白的转录调控伙伴蛋白,具体机制有待进一步研究。

关键词： rorγ 蛋白质相互作用串联亲和纯化 HSP90 RIP140

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鲤鱼rorγ和STAT3基因的克隆及对Th17细胞免疫功能影响

鲤鱼RORγ和STAT3基因的克隆及对Th17细胞免疫功能影响

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作者：常强山东师范大学

学位级别：硕士

辅助性T细胞是组成型表达TCRαβ和CD4分子的T细胞,根据CD4+T细胞在受到病原刺激的情况所分泌的细胞因子不同将其分为Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)、Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)和Th17细胞。其中Th17细胞的名字来源就在于它能够主要产生IL-17(IL-17A... 详细信息

辅助性T细胞是组成型表达TCRαβ和CD4分子的T细胞,根据CD4+T细胞在受到病原刺激的情况所分泌的细胞因子不同将其分为Ⅰ型辅助性T细胞(Th1)、Ⅱ型辅助性T细胞(Th2)和Th17细胞。其中Th17细胞的名字来源就在于它能够主要产生IL-17(IL-17A和IL-17F),由它分化而来的天然免疫组分会在适应性免疫与天然免疫共同对抗炎症反应构建的第一道防线中起作用,而它大多数功能都是由其分泌物,即IL-17所决定的。Th17的作用包括招募中性粒细胞、激活天然免疫细胞、增强B细胞功能、释放促炎性细胞因子如TNF和IL-1β等。另外IL-17信号通路还可以促进细胞因子和其他炎症因子,如胞间粘附分子、抗菌肽和金属蛋白酶的分泌,从而维持正常的机体环境,避免组织损伤。Th17细胞可由IL-6,TGF-β,IL-21和IL-23共同诱导分化成为成熟Th17细胞,这过程还依赖信号传导与转录活化因子STAT3的激活。另外视黄酸相关孤儿受体rorγ和rorα也能够作为转录因子参与Th17细胞的分化,而rorγ的转录活性同时又受到STAT3的调控。目前在硬骨鱼中,只有斑马鱼和草鱼的ror基因被鉴定出来,包括rorα1,rorα2,rorβ,rorγ1和rorγ2,并且人们在斑马鱼胚胎发育过程中对这几个基因的表达情况进行了检测,但对其免疫调控方式和鱼类中的免疫学功能并未有研究。而STAT3在硬骨鱼中虽研究相对较多,但在鲤鱼中STAT3基因克隆与功能研究并无相关报道。本论文以鲤鱼为研究模型,首先根据STAT3和rorγ的保守区设计多对引物克隆得到部分片段并将其进行拼接,首次得到了总长度为2157bp的STAT3基因完整ORF(开放阅读框)和长度为732bp的rorγ基因编码片段。用SMART软件进行蛋白预测分析,确定STAT3含有一个STAT-int(2-122)结构域及一个SH2特征性结构域(583-664),同时还有两个螺旋结构域(136-223,268-292)。鲤鱼rorγ基因的732bp核苷酸编码243个氨基酸,其中在46-202之间构成了HOLI结构域。我们对该序列与多物种进行比对构建系统进化树,发现鲤鱼与草鱼的rorγ基因处于同一分支,相似性为85%,而STAT3的亲缘关系与斑马鱼最为接近。为进一步研究Th17细胞所分泌细胞因子的免疫功能,我们选取了鲤鱼IL-17AF2基因作为Th17细胞的功能代表性细胞因子,克隆得到其部分片段后并通过荧光定量PCR分析其组织分布。结果发现IL-17AF2在头肾中表达量最高,肝脏次之,其次为脾脏、皮肤、前肠、后肠和鳃。为研究病毒感染后鲤鱼免疫系统中IL-17AF2的表达变化,我们用PolyI:C注射刺激鲤鱼,同时队体外鲤鱼头肾白细胞进行刺激,分别在不同的时间段运用Real-time PCR检测其mRNA水平,结果显示鲤鱼IL-17AF2基因的表达量均被上调,其中在头肾和皮肤中含量升高最明显,而在鳃中的升高变化量较小。其中在IL-17AF2基因表达上调最明显的组织和时间段内,STAT3和rorγ的含量均有相应的升高。综上检测结果说明IL-17AF2与鲤鱼的抗病毒免疫反应有关,而Th17的功能发挥很可能与STAT3和rorγ相关。

关键词：鲤鱼 Th17相关细胞因子 STAT3 rorγ IL-17AF2 基因克隆

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TLR4-MyD88-NF-kB信号通路在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义

TLR4-MyD88-NF-kB信号通路在溃疡性结肠炎中的表达及临床意义

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作者：周璐郑州大学

学位级别：硕士

背景炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease IBD)是一种常见的消化道疾病,主要有克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)两种疾病形式,目前病因未被阐明,较多学者认为疾病的发生与微生物介导的粘膜免疫反应失调有关。模式识别受体(PRR)识别病... 详细信息

背景炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease IBD)是一种常见的消化道疾病,主要有克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)两种疾病形式,目前病因未被阐明,较多学者认为疾病的发生与微生物介导的粘膜免疫反应失调有关。模式识别受体(PRR)识别病原微生物和凋亡细胞表面的特定分子结构。损伤相关分子模式(DAMP)、病原体相关分子模式(PAMP)均是通过PRR激活先天性免疫反应。Toll样受体(TLR)属于PRR的一种,既往研究报告表明,在DSS诱导小鼠结肠炎模型中,TLR介导的免疫反应存在异常激活,但关于其在IBD患者结肠组织中的表达研究较少,仍有待进一步探讨。目的探讨UC患者结肠活检组织TLR4、MyD88、NF-kBp65、rorγ的表达水平,明确TLR介导的炎症通路及其下游表达产物与UC的关系,并分析与临床炎症指标的相关性。材料和方法1.UC患者结肠组织标本的收集:收集2019年12月-2020年12月入院或门诊治疗的UC患者结肠活检组织标本共30例,其中缓解期7例,活动期23例,其中轻度8例,中度7例,重度8例,另收集10例同期结直肠癌切除的癌旁组织标本(距癌旁均超过5 cm)。2.收集UC患者入院时的血沉及C-反应蛋白检验结果,与免疫组化结果中各指标表达进行相关性分析。3.研究所得数据采用SPSS 23.0统计软件分析,每组各检测指标的量化表达水平、年龄、病程用平均值±标准差((?)±s)表示。阴性对照组、缓解期UC、轻度UC及中重度UC结肠组织中各指标表达比较采用单因素方差分析;各指标表达情况与血沉及CRP的相关性使用Spearman相关性分析及散点图表示。P0.05)。3.UC患者结肠组织中MyD88的表达MyD88主要表达于结肠组织中的细胞质中。阳性表达为棕褐色、黄色颗粒。中重度UC患者中MyD88的阳性表达最高,其次为轻度UC患者。阴性对照组及缓解期UC患者中,MyD88蛋白表达较少,染色浅。对表达强度量化后,中重度UC患者中MyD88的表达分数较轻度、缓解期及阴性对照组明显升高,轻度组高于缓解期及对照组(P0.05)。4.UC患者结肠组织NF-kBp65的表达NF-kBp65定位细胞核和胞浆中,阳性为棕褐色颗粒。中重度UC患者结肠组织中可见大量棕黄色黄染区域,阳性表达最高。轻度UC患者中NF-kBp65表达表现为弱阳性,在缓解期UC患者及阴性对照组中,NF-kBp65蛋白表达少,染色浅。对表达强度量化后,中重度UC患者中NF-kBp65的表达分数较轻度、缓解期及阴性对照组明显升高,轻度UC较缓解期及阴性对照组升高(P0.05)。5.UC患者结肠组织rorγ的表达rorγ主要在结肠组织细胞的细胞核中表达,阳性为棕褐色颗粒。中重度组rorγ表达水平最高,轻度组rorγ表达低,对照组及缓解期中,rorγ蛋白表达较少,染色浅。对表达强度量化后,中重度组rorγ的表达分数较轻度、缓解期及对照组明显升高,轻度较缓解期及对照组升高(P0.05)。6.UC患者结肠组织中TLR4、MyD88、NF-kBp65、rorγ与血沉及CRP相关性分析TLR4(r=0.447,Prorγ(r=0.485,Prorγ(r=0.447,Prorγ表达增强,且与疾病严重程度相关。2、TLR4、NF-kBp65、rorγ表达与血沉及CRP水平呈正相关,MyD88表达仅与血沉呈正相关。

关键词：溃疡性结肠炎 TLR4 MyD88 NF-kBp65 rorγ

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炎症性肠病的肠黏膜免疫调控机制及黄芪多糖治疗作用的探讨

炎症性肠病的肠黏膜免疫调控机制及黄芪多糖治疗作用的探讨

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作者：戴佳原北京协和医学院

学位级别：硕士

研究背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种病因未明的慢性复发性免疫性肠道疾病,迄今无根治方法,近年来在我国发病率呈明显上升。肠道黏膜异常免疫应答启动的关键环节树突状细胞（dendritic cells,DCs）及其... 详细信息

研究背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）是一种病因未明的慢性复发性免疫性肠道疾病,迄今无根治方法,近年来在我国发病率呈明显上升。肠道黏膜异常免疫应答启动的关键环节树突状细胞（dendritic cells,DCs）及其下游的调节性T细胞（Treg）和Th17细胞比例失衡可能在IBD中发挥了重要作用。近年来,中医基础和临床研究发展迅速,在IBD治疗方面取得了一定的临床疗效。黄芪是最常用的几种中药之一,已有研究发现黄芪提取物可预防和治疗实验性结肠炎,但关于其主要生物活性成份黄芪多糖（astragalus polysaccarides,APS）对结肠炎的治疗效果及确切作用机制目前尚无研究报道。研究目的探讨2,4,6-三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠实验性结肠炎的肠黏膜免疫调控机制及APS的治疗作用。研究方法 1.建立TNBS实验性结肠炎模型：32只雄性SD大鼠随机分为4组（n=8）,空白对照组、TNBS模型组、APS治疗组、5-氨基水杨酸（5-ASA）治疗组。除空白对照组外,其余3组均给予TNBS灌肠造模。造模后第二天,APS治疗组和5-ASA治疗组大鼠分别给予APS（0.75 g·kg-1·d-1）和5-ASA（100mg·kg-1·d-1）灌胃治疗10天。每天观察大鼠体重、腹泻及血便情况,给药结束后处死大鼠取材。 2.疗效评价：观察结肠大体标本及镜下病理标本炎症情况,测定肠道组织髓过氧化物酶（MPO）活性。 3.免疫机制研究：免疫磁珠法分离大鼠肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes, MLNs）中的DCs,流式细胞仪检测DCs表面标志MHCII、CD86的表达。采用免疫组化和免疫印迹检测肠道组织中Treg及Th17特异性转录因子Foxp3和rorγ的表达。实验结果 1.TNBS模型组大鼠结肠大体病变、镜下病理炎症评分及MPO活性均显著高于空白对照组（P=0.004）。APS治疗可显著减轻结肠大体及镜下炎症评分,降低MPO活性,但无统计学意义（P=0.183）。5-ASA治疗组大鼠的大体、镜下炎症病变评分以及MPO活性均较模型组显著下降。 2. TNBS组大鼠肠系膜淋巴结DCs表面标志MHCⅡ和CD86的表达率较空白对照组、APS组及5-ASA组显著升高（P＜0.05）。APS及5-ASA治疗后MHCⅡ和CD86的表达率较TNBS模型组大鼠显著降低（P＜0.05）。 3.免疫组化显示TNBS实验性结肠炎大鼠肠道Foxp3的表达较正常大鼠有所降低（P=0.424）,rorγ显著升高（P=0.027）。APS及5-ASA干预可升高大鼠肠道Foxp3的表达,降低rorγ的表达。 4.免疫印迹显示TNBS实验性结肠炎大鼠肠道Foxp3的表达较正常大鼠显著降低,rorγ较正常大鼠显著升高,Foxp3/rorγ的比值较正常大鼠显著降低P=0.001)。APS治疗组大鼠肠道Foxp3表达较TNBS模型组有所升高,但无统计学意义（P=0.072）,rorγ的表达较TNBS造模大鼠显著降低（P=0.014）,Foxp3/rorγ的比值有所升高（P=0.111）。5-ASA治疗组大鼠肠道Foxp3的表达较TNBS模型组有所升高,rorγ的表达有所降低,Foxp3/rorγ的比值有所升高,但差异均无统计学意义（P＞0.05）。实验小结 1. APS（0.75 g·kg-1·d-1）灌胃治疗10天可部分缓解TNBS诱导的大鼠结肠炎。5-ASA的疗效略优于APS。 2. TNBS实验性结肠炎大鼠肠道DCs表面标志MHCⅡ和CD86的表达率升高,APS和5-ASA治疗后,其表达率均降低。 3.TNBS实验性结肠炎大鼠肠道Foxp3/rorγ的比值显著降低。APS和5-ASA可通过对Foxp3、rorγ的调控作用,升高Foxp3/rorγ比值,有助于恢复实验性结肠炎大鼠肠道Treg/Th17平衡。结论 TNBS实验性结肠炎急性期,活化的DCs表达增多,Treg/Th17失衡。APS治疗可部分缓解大鼠实验性结肠炎,下调肠系膜淋巴结中活化的DCs,并通过调节转录因子Foxp3及rorγ的表达,使异常的Treg/Th17趋于平衡,可能是其发挥抗炎、肠道保护作用的免疫机制。

关键词： 2，4，6-三硝基苯磺酸炎症性肠病黄芪多糖树突状细胞 Foxp3 rorγ Treg/Th17平衡

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