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弓形虫SAG1,rop1基因及其复合抗原基因的核酸免疫研究

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北华大学学报（自然科学版） 2008年第4期9卷 314-316页

作者：李薇刘玉和刘波北华大学医学检验学院

目的检测混合SAG1和rop1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果．方法将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体，构建重组质粒；RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达；通过检测... 详细信息

目的检测混合SAG1和rop1编码基因真核表达质粒疫苗诱导小鼠的免疫应答，评价其抗弓形虫感染的保护性免疫效果．方法将SAG1和编码基因片段克隆入pEGFP-N3表达载体，构建重组质粒；RT-PCR体外验证重组质粒在NH3T3细胞中的表达；通过检测抗体、抗体分型及细胞因子来评价体液免疫和细胞免疫：腹腔内注射毒性株弓形虫速殖子攻击免疫小鼠．结果 RT-PCR结果显示重组质粒能在哺乳动物细胞内表达；SAG1和rop1混合重组质粒疫苗诱导小鼠产生很强的体液免疫和细胞免疫，对于毒性株弓形虫感染攻击具有保护作用．结论不同候选抗原编码基因重组质粒能够诱导小鼠产生抗弓形虫感染保护性免疫，提示含有多种成分的混合DNA疫苗的研制可作为核酸免疫研究的策略之一．

关键词：弓形虫 DNA免疫 SAG1 rop1

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弓形虫RH株rop1抗原基因的克隆与表达

中国人兽共患病杂志 2001年第5期17卷 37-40页

作者：杨秋林陆惠民施宓黄伟达苏州医学院寄生虫学教研室苏州215007 复旦大学生命科学院生物化学系

目的　在大肠杆菌中高效表达rop1抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株cDNA文库中扩增得到编码rop1的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并用SDS ... 详细信息

目的　在大肠杆菌中高效表达rop1抗原。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)从弓形虫RH株cDNA文库中扩增得到编码rop1的基因 ,经DNA序列分析后导入表达载体pGEX - 5x - 3 ,然后在大肠杆菌BL2 1中进行表达 ,用亲和层析柱纯化表达产物 ,并用SDS -PAGE和Westernblotting进行鉴定。结果　 ( 1)在我们比较的 12 4 9个碱基中 ,我们得到的rop1基因在Ossorio报道的基因的 4 4 7位与 4 4 8位之间有一 96bp的插入片段 ,另有 14个碱基不同 ,造成 3个氨基酸的改变 ,两基因之间有 91.19%的同源性 ,( 2 )得到一分子量约为 70kDa的融合蛋白。结论　 1,我们获得了一与Ossorio报道的基因有较大差异的rop1基因 (GeneBank登录号 :AF3 5 0 2 61) ( 2 ) ,rop1基因在大肠杆菌中得到了rop1融合蛋白的高效表达。

关键词：弓形虫 rop1 PCR 基因表达基因克隆

弓形虫复合抗原基因SAG1/rop1在大肠杆菌中表达的初步研究

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中国人兽共患病杂志 2001年第2期17卷 8-10页

作者：陈海峰陈观今郭虹郑焕钦王又红中山医科大学寄生虫学研究所广州510089

目的　构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白rop1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法　用亚克隆技术分别把SAG1与rop1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细... 详细信息

目的　构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白rop1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法　用亚克隆技术分别把SAG1与rop1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果　获得pET2 8-SAG1/rop1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/rop1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论　弓形虫复合抗原基因SAG1/rop1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。

关键词：弓形虫 SAG1 rop1 基因表达抗原基因大肠杆菌

利用人工微RNA干扰技术鉴定拟南芥小孢子发育基因及其分子机理

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利用人工微RNA干扰技术鉴定拟南芥小孢子发育基因及其分子机理

作者：王琢玉中国农业科学院

学位级别：硕士

油菜是我国及世界重要的油料作物之一,其杂种优势明显。由不同育性控制基因所构成的授粉控制系统是目前油菜杂种优势利用的主要技术途径。然而目前克隆鉴定的育性控制基因很少,对配子发育的分子机制了解更少。本研究利用高效的microRNA... 详细信息

油菜是我国及世界重要的油料作物之一,其杂种优势明显。由不同育性控制基因所构成的授粉控制系统是目前油菜杂种优势利用的主要技术途径。然而目前克隆鉴定的育性控制基因很少,对配子发育的分子机制了解更少。本研究利用高效的microRNA干扰新技术鉴定了多个配子发育或育性控制基因,并研究了相关的分子机制,为配子发育调控和新型授粉控制系统的构建打下了一定的基础。本研究的简要技术路线是:基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了油菜差异表达基因,用Q-PCR研究其在油菜可育株和不育株不同组织中的表达水平,根据组织表达特异性筛选出用于功能研究的基因,然后根据候选基因序列构建人工microRNA (amiRNA)干扰载体,转化拟南芥,筛选植株并进行表型鉴定,从分子生物学和细胞生物学角度研究基因作用的分子机理。主要研究结果如下:1、amiRNA干扰技术的建立和用于功能基因鉴定的可行性分析选择一个与油菜基因同源的拟南芥基因AT2G19070,二者在不同组织中的表达模式相同,在油菜cDNA-拟南芥芯片中该基因在可育株花蕾中高量表达,不育株花蕾中表达量受到显著抑制,因此它与育性控制相关。基于AT2G19070序列设计了两个靶标序列,构建了相应的amiRNA干扰载体,然后通过浸花法转化拟南芥。转基因拟南芥植株和后代的小孢子数量明显减少,成熟花粉粒皱缩失去活力,不结实或者极少结实,表现为雄性不育表型。该转基因植株的表型和T-DNA插入突变体及RNAi转基因植株相同。这说明amiRNA干扰技术用于研究基因功能是可行和可靠的。通过对该基因的研究我们成功的建立了amiRNA干扰技术体系和鉴定体系,为研究油菜基因的功能提供了有效的技术手段。2、一个新雄配子发育控制基因PDF1的克隆和转基因分析PDF1是一个未知功能的基因。芯片杂交结果显示,AT2G42840的油菜同源基因BnPDF1在油菜可育株和不育株中的表达具有显著差异。本研究采用荧光定量PCR方法,对该油菜基因在根、茎、叶、花、雌蕊、雄蕊、角果中的表达模式进行了分析,显示它是一个可育株雄蕊高量表达基因。BnPDF1在油菜雄蕊中的表达和花药育性显著相关。因此本研究从芸薹属3个亲缘种白菜、油菜和甘蓝中分别克隆PDF1基因的序列,进行各种生物信息学分析和同源比对,预测结果显示它们同AtPDF1具有类似的功能。此外构建AtPDF1基因的GFP标记的亚细胞定位载体并用基因枪轰击洋葱表皮细胞的实验证实PDF1基因定位于细胞质膜上。在此基础上构建microRNA干扰载体,通过农杆菌介导的拟南芥转化,获得97株转基因苗。T1代转基因苗的表型观察发现,有61株出现角果数量减少或不结实,无花粉,花药萎缩以及小孢子数量、角果数量大大减少的全不育和半不育表型。Q-PCR和Northern杂交实验证实转基因拟南芥中PDF1基因确实发生了剪切,产生了21bp的剪切小体,表达水平受到了显著的抑制。上述研究结果表明,在拟南芥中干扰AtPDF1基因的表达导致拟南芥出现雄性不育的表型。PDDF1是一个新的具有调控小孢子发育和花药育性功能的基因。3、PDF1,一个新的PCD抑制因子,在植株生长、发育中起到重要调控作用为了揭示PDF1控制小孢子发育的分子机理,我们对转基因拟南芥进行了深入的细胞学分析。通过对转基因植株进行细胞学染色、切片观察等方法,显示转基因后代小孢子败育发生在四分体到单核期。在这个时期小孢子的细胞核出现了异常的降解现象,而且在整个小孢子发育中都无法检测到明显的细胞核,即产生了异常的PCD现象。随后,本研究采用DNA Ladder技术对小孢子细胞中发生的PCD现象进行了证实。同时在转基因植株中出现明显的矮化表型。根据这一提示,我们通过荧光染色观察转基因植株的茎和叶片,发现在叶肉细胞和茎的外表皮细胞中也出现了细胞核降解的PCD现象。转基因T2代株系的荧光定量分析实验证实,在PDF1表达量几乎完全抑制的条件下,具有抑制PCD途径功能的基因如MS1,FBR,SPT的表达量均显著下调;而促进PCD途径的基因如MMD,DAD均上调。由此推断PDF1基因是一个新的细胞程序性死亡的抑制因子,它通过抑制PCD的异常启动来确保细胞分化、分裂以及正常发育。抑制该基因的表达会诱导PCD的提早发生,从而导致细胞败育,造成植株的雄性不育和矮化。这些结果为我们深入分析PDF1的作用机理和雄性不育分子机理提供了有意义的线索。4、油菜rop1同源基因沉默导致拟南芥雄性不育基于油菜杂合双显性雄性核不育系和拟南芥全基因组芯片的表达谱分析结果,选择了一个油菜差异表达基因,其对应的拟南芥同源基因为AT3G51300(ATRO

关键词： rop1 PDF1 人工microRNA干扰雄性不育分子机制