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利用rnase Ⅲ缺陷型菌株发酵hpRNA防治烟草花叶病毒

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利用RNase Ⅲ缺陷型菌株发酵hpRNA防治烟草花叶病毒

作者：张国胜河南农业大学

学位级别：硕士

本研究依据RNAi机制,以TMV外壳蛋白基因序列为模板,构建含反向重复片段的表达载体,进而转化rnaseⅲ缺陷型大肠杆菌（DY330）中,得到可以表达hpRNA的工程菌,发酵工程菌提取hpRNA后喷洒烟叶以抵抗TMV。试验主要内容包括: 1、构建表达hp... 详细信息

本研究依据RNAi机制,以TMV外壳蛋白基因序列为模板,构建含反向重复片段的表达载体,进而转化rnaseⅲ缺陷型大肠杆菌（DY330）中,得到可以表达hpRNA的工程菌,发酵工程菌提取hpRNA后喷洒烟叶以抵抗TMV。试验主要内容包括: 1、构建表达hpRNA的工程菌DY-hp 根据TMV外壳蛋白基因序列设计引物,提取烟叶总RNA、反转录、PCR获得cDNA,测序比对结果显示相似性为98.33%。以cDNA为模板,扩增大、小两片段,将与T载体相连,得到含反向重复片段的克隆载体,测序比对结果显示一致性为99.73%。将反向重复结构与表达载体pET-21a相连后转化rnaseⅲ缺陷型菌株（DY330）得到表达hpRNA的工程菌DY-hp。 2、菌株DY-hp发酵hpRNA的条件优化测定了DY-hp的生长曲线,发现IPTG诱导4小时后hpRNA产量最高,又对IPTG诱导浓度和诱导菌浓进行了优化,结果是当OD600值为0.4、IPTG为0.4mM时hpRNA产量最大,此时每毫升发酵液得到约23μg hpRNA。 3、喷洒hpRNA处理烟叶实验一共六个处理:接种TMV三天前喷洒hpRNA、接种TMV三天后喷洒hpRNA、接种TMV并喷洒含空载体菌株DY-control发酵提取物、只接种TMV、只喷洒hpRNA、空白对照,实验重复三次,hpRNA预防TMV的处理抗病率达到65%,治疗TMV的处理抗病率为40%。本研究创新性采用一步单酶切、一步酶连高效、便捷的得到了同源于TMV外壳蛋白基因序列的反向重复结构,最终成功得到了高效表达hpRNA的工程菌DY-hp,并对DY-hp发酵进行了简单优化,最后通过hpRNA喷洒烟苗处理证实hpRNA达到65%抗TMV的预防效果。

关键词： rnaseⅲ hpRNA 烟草花叶病毒发酵外壳蛋白

金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ的催化机理研究和动粒蛋白Mis12复合物与相关蛋白的相互作用研究

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金黄色葡萄球菌RNase Ⅲ的催化机理研究和动粒蛋白Mis12复合物与...

作者：肖恋中国科学技术大学

学位级别：硕士

双链RNA (dsRNA)可由初级转录本互补配对产生,在细胞中广泛存在,并发挥多种生物学效应。而且,dsRNA也是许多病毒的遗传物质。在细菌和真核细胞中,rnase Ⅲ家族(核糖核酸内切酶Ⅲ)的成员选择性地识别和剪切dsRN A,在基因表达和调控,宿主... 详细信息

双链RNA (dsRNA)可由初级转录本互补配对产生,在细胞中广泛存在,并发挥多种生物学效应。而且,dsRNA也是许多病毒的遗传物质。在细菌和真核细胞中,rnase Ⅲ家族(核糖核酸内切酶Ⅲ)的成员选择性地识别和剪切dsRN A,在基因表达和调控,宿主防御和基因组监控等过程中扮演着重要的角色。rnase Ⅲ家族成员对dsRNA的加工是编码RNA和非编码RNA成熟和衰变过程中的关键步骤,甚至在miRNA和siRNA的生成中也起着重要作用。rnase Ⅲ是二价金属离子依赖的磷酸二酯酶。rnase Ⅲ家族成员有一个独特的rnase Ⅲ结构域,以二聚体形式发挥其酶活,结合dsRNA,并剪切每条链上的磷酸二酯键,产生一个特征性的3’端有2个核苷酸突起的产物。为了了解金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ与其他细菌rnase Ⅲ之间的异同,我们解析了金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ的晶体结构,并对其进行了分析。我们发现金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ与其他细菌rnase Ⅲ整体结构相似,两个rnase Ⅲ结构域通过疏水作用形成紧密的二聚体,同时参与金属离子配位的活性中心关键氨基酸残基也是保守的。通过体外酶活实验,我们发现：金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ在二价金属离子条件下催化dsRNA底物的水解;不同二价金属离子对金黄色葡萄球菌rnase Ⅲ催化效率的影响有差异,相对于Mg2+,Mn2+条件下Sa-rnase Ⅲ有更强的催化活性,Ca2+和Ni2+则会抑制其活性。而活性中心关键氨基酸残基的突变会大大减弱Sa-rnase Ⅲ的催化活性。动粒是一个大的蛋白网络,在有丝分裂时期陆续组装到着丝粒染色体上。它连接姐妹染色单体和纺锤体微管,促进姐妹染色单体准确分离到纺锤体的两极。动粒主要由内层的CCAN蛋白网络和外层的KMN蛋白网络组成。KMN蛋白网络主要由Kn11, Mis12复合物及Ndc80复合物组成。Mis12复合物是连接内外层动粒的桥梁,它与CENP-C发生相互作用而被招募至动粒,又通过与Knl1和Ndc80复合物的相互作用,招募其它外层动粒组分,进而促进动粒和微管的连接。尽管关于外层动粒的研究很多,到目前为止,KMN蛋白网络内Mis12复合物与Ndc80复合物相互作用的具体方式和调节机制还不是很清楚。在减数分裂Ⅰ期,姐妹染色单体的动粒结合到来自同一方向纺锤体的微管,称为单极定向。在酿酒酵母中,单极定向主要依赖于四亚基的monopolin复合物。Monopolin复合物在减数分裂Ⅰ期结合到姐妹染色单体的动粒上,并促进单极定向。然而目前monopolin复合物在动粒上的结合位点以及发挥作用的机制还不是很清楚。有研究发现,monopolin复合物亚基Csm1可能通过与MIN D复合物(人源Mis12复合物在酿酒酵母中的同源物)亚基Dsn1相互作用,而将姐妹动粒机械融合,从而促进姐妹染色单体的单极定向。我们尝试通过体外重组表达的方法,来获得纯度较高的人源Mis12复合物亚基Dsn1和Nsll的截短体与人源和裂殖酵母中的Ndc80bonsai蛋白,并尝试通过体外pull-down方法检测人源和裂殖酵母两个物种中Ndc80复合物与Mis12复合物的相互作用。另外,我们表达纯化了酿酒酵母的Csm1口Dsn1蛋白,通过pulldown方法验证了两者间的相互作用。我们还进行了酿酒酵母Csm1与Dsn1多肽复合物的晶体筛选和初步的晶体优化实验。

关键词：金黄色葡萄球菌双链RNA rnaseⅲ 动粒 Mis12 复合物Ndc80复合物单极定向 Monopolin复合物 Csm1 Dsn1

Cost-effective method of siRNA preparation and its application to inhibit hepatitis B virus replication in HepG2 cells

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World Journal of Gastroenterology 2005年第9期11卷 1297-1302页

作者： Zhi-KangQian Bao-QinXuan Tai-ShanMin Jian-FengXu LinLi Wei-DaHuang DepartmentofBiochemistry SchoolofLifeSciencesFudanUniversity220HandanRoadShanghai2130433China

AIM: To find a cost-effective method of preparation of short interfering RNAs based on cloning, fermentation, digestion and purification (CFDP) and test its feasibility to inhibit hepatitis B virus replication in cell culture. METHODS: We constructed an expression vector containing T7 and tac promoter in a head-to-head orientation. cDNA fragment of interest was cloned into this vector between the opposing promoters. dsRNAs were expressed with this vector in Escherichia coli, and purified by affinity chromatography using CF 11 column. They were digested by rnase III in a buffer containing manganese ions, then separated on 15% non-denaturing PAGE, and the siRNAs about 25 bp in length were recovered. siRNAs prepared with CFDP were co-transfected with target gene expression plasmid into human cell lines with lipofectamine 2 000 to test their inhibition efficiency. RESULTS: siRNAs corresponding to part of the hepatitis B virus polymerase gene (siHBVP) prepared by CFDP specifically and dramatically suppressed the virus protein expression. The HBsAg expression level was reduced to 10% that of the control by co-transfection of 60 nmol/L siHBVP in SMMC7721 cells. Dose-dependent effect on suppression of HBsAg and HBeAg expression was observed in HepG2 cells. The highest inhibition rate was kept at 70% during the six days after transfection of 7.5 nmol/L siHBVP. CONCLUSION: We show CFDP is a very promising method to prepare therapeutic agents in anti-virus applications.

关键词： HBV RNAi rnaseⅲ siRNA

Resistance of non-transgenic papayas to papaya ringspot virus(PRSV) mediated by intron-containing hairpin dsRNAs expressed in bacteria

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Resistance of non-transgenic papayas to papaya ringspot viru...

布鲁氏菌核糖核酸酶RibonucleaseⅢ的酶活性研究

第六届海南省生命科学联合学术会议

作者： Wentao Shen Guofeng Yang Yao Chen Pu Yan Decai Tuo Xiaoying Li Peng Zhou Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops Ministry of AgricultureInstitute of Tropical Bioscience and Biotechnology & Analysis and testing centerChinese Academy of Tropical Agricultural Sciences College of Life Sciences Hainan Normal University

RNA-mediated virus resistance based on natural antiviral RNA silencing has been exploited as a powerful tool for engineering virus resistance in *** this study,a conserved 3’-region(positions 9839-10117,279 nt) of the capsid protein(CP) gene of Papaya ringspot virus(PRSV),designated CP279,was used to generate an intron-containing hairpin RNA(ihpRNA) construct by one-step,zero-background ligation-independent cloning(OZ-LIC).The rnaseⅲ-deficient *** strain M-JM1091 acY was identified as the best choice for producing large quantities of specific *** analyses and ELISA data verified that most papaya plants mechanically coinoculated with TRIzol-extracted ihpRNA-CP279 and PRSV were resistant to PRSV,and resistance was maintained throughout the test period(>2 months post-inoculation).In contrast,a 1-2-day interval between sequential inoculation of PRSV and ihpRNA-CP279 did not result in complete protection against PRSV infection,but delayed the appearance of viral symptoms by 3 to 4 *** findings indicate that direct mechanical inoculation of nontransgenic papaya plants with bacterially-expressed ihpRNA-CP279 targeting the PRSV CP gene can interfere with virus *** work lays a foundation for developing a non-transgenic approach to control PRSV by directly spraying plants with ihpRNA or crude bacterial extract preparations.

关键词： PRSV RNA silencing RNA-mediated virus resistance hairpin RNA rnaseⅲ

来源： cnki会议评论

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布鲁氏菌核糖核酸酶RibonucleaseⅢ的酶活性研究

作者：许先进华中农业大学

学位级别：硕士

布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性细菌,侵入人畜细胞后能够逃避宿主免疫系统并建立慢性感染,但其逃避免疫的机制还不完全清楚。最近研究发现,RibonucleaseⅢ(rnaseⅲ)、rnaseE和Hfq参与非编码RNA的调控,进而影响基因的表达。RNas... 详细信息

布鲁氏菌是一种兼性胞内寄生的革兰氏阴性细菌,侵入人畜细胞后能够逃避宿主免疫系统并建立慢性感染,但其逃避免疫的机制还不完全清楚。最近研究发现,RibonucleaseⅢ(rnaseⅲ)、rnaseE和Hfq参与非编码RNA的调控,进而影响基因的表达。rnaseⅲ广泛地存在于细菌、真菌及真核生物中,是一类保守性很高的酶类。在体外,rnaseⅲ能够切割任何完全配对的具有双链结构的RNA,包括细菌自身RNA及病毒RNA。已有研究表明布鲁氏菌能够通过4型分泌系统将效应蛋白分泌到宿主细胞中,从而有利于布鲁氏菌在细胞中的运输。布鲁氏菌在侵入到宿主细胞后,是否会有rnaseⅲ通过4型分泌系统进入到宿主细胞中,在RNA水平影响宿主基因表达,以使布鲁氏菌能够更好的潜伏和增殖还未见报道。本课题克隆了羊种布鲁氏菌Brucella melitensis编码rnaseⅲ的基因rncS,并对rnaseⅲ的重要氨基酸进行突变,获得rncS突变克隆ncS (E54A、D61A、E81A、E133A)。选择布鲁氏菌编码的具有双链结构的RNA BM-pri-0015、BM-pre-0015以及miRBase收录的人源及伪狂犬病毒编码的成熟miRNAs的前体Hsa-let-7a-1、 Hsa-mir-16-1、PRV-LLT1、PRV-LLT2作为rnaseⅲ的切割底物。首先,用凝胶阻滞实验(EMSA)检测RNA和rnaseⅲ的结合;其次,比较rnaseⅲ在切割这几种不同来源的具有双链结构的RNA生化活性的差异：包括金属离子(镁离子和锰离子)对切割活性的影响,盐离子(钠离子和钾离子)对切割活性的影响,pH对酶活性的影响;在此基础上,检测rnaseⅲ突变体的酶活,确定对rnaseⅲ酶活起到重要作用的氨基酸。本课题所得结果如下：1.凝胶阻滞实验表明rnaseⅲ不仅可以和布鲁氏菌编码的RNA结合,也可以和来自人源的及病毒的RNA结合;***Ⅲ在含有锰离子或者镁离子时才能发挥切割活性,不同的底物所需的金属离子最适浓度不一样;***Ⅲ在没有盐离子条件下具有切割活性;***Ⅲ在碱性条件下的切割活性高,在酸性条件下酶活受到了抑制;***的第133位氨基酸是酶活性所必须的。本课题通过rnaseⅲ的酶活实验表明布鲁氏菌rnaseⅲ的切割底物没有序列特异性,确定了rnaseⅲ的最佳酶活反应条件及必须氨基酸,为实验室研究布鲁氏菌非编码RNA提供了酶工具。

关键词：布鲁氏菌 rnaseⅲ 切割活性

金黄色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物学功能研究

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金黄色葡萄球菌TRAP蛋白及VraX蛋白的生物学功能研究

作者：谭小蓉中南大学

学位级别：硕士

1. TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金黄色葡萄球菌的机制研究;2.假定蛋白VrX参与金黄色葡萄球菌天然耐药的机制研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是一种常见的革兰氏阳性致病菌,广泛分布于自然界中,通过飞沫、接触... 详细信息

1. TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金黄色葡萄球菌的机制研究;2.假定蛋白VrX参与金黄色葡萄球菌天然耐药的机制研究金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,金葡菌)是一种常见的革兰氏阳性致病菌,广泛分布于自然界中,通过飞沫、接触等途径传播并引起多种疾病。当金葡菌侵入机体时,机体会通过补体系统、吞噬细胞、不饱和脂肪酸等多种防御系统清除入侵细菌。同时金葡菌自身在感染机体的过程中,也会表达多种分子对抗机体的清除作用。近年来由于抗生素滥用,导致了多种耐药性金葡菌的出现,耐药金葡菌引发的感染是临床面临的棘手难题。本论文主要针对以下两个内容展开了相关的研究,具体如下：①TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金葡菌的机制研究;②假定蛋白VraX参与金葡菌天然耐药的机制研究。本研究的第一部分为TRAP蛋白参与长链不饱和脂肪酸杀伤金黄色葡萄球菌的机制研究。长链不饱和脂肪酸一般指≥C16,含有一个以上双键的脂肪酸。相关研究表明,该类脂肪酸是天然免疫系统中重要的组成成分,具有抗金葡菌感染的能力。TRAP是金葡菌致病性相关的蛋白分子,目前关于它的生物学功能存在争议,其确切功能尚不清楚。该部分内容具体如下：1.△traP对亚油酸的敏感性检测：我们实验室前期通过基因同源重组的方法获得了traP基因的缺失突变株(△traP),当其与亚油酸进行共孵育培养时,与野生型菌株相比,其存活率明显降低。通过基因芯片对比分析我们发现在△traP中与脂代谢相关联的基因fadD的mRNA水平明显降低。***对亚油酸的敏感性检测：我们通过基因同源重组的方法获得了fadD基因缺失突变株(△fadD).进一步的实验结果发现,△fadD对亚油酸敏感性也明显增强。我们在△traP中回复fadD的水平,但其对亚油酸的敏感性未得到回复。***蛋白通过与FadD蛋白相互作用参与亚油酸杀伤金葡菌的过程：通过免疫共沉淀实验及质谱鉴定的方法,我们发现FadB和FadD可能是TRAP的结合蛋白。进一步的ELISA实验结果表明只有FadD蛋白能够特异与TRAP蛋白结合。这表明TRAP蛋白通过与FadD蛋白相互作是其影响亚油酸对金葡菌杀伤的主要机制。本论文的第二部分为假定蛋白VraX参与金黄色葡萄球菌天然耐药的机制研究。天然耐药是指在抗生素作用下,抗生素敏感细菌中的一部分可以存活和繁殖,成为接收外来耐药基因的载体。研究表明抗生素作用下,金葡菌中的多种分子异常表达对抗药物的杀伤作用。通过文献调研发现,多种抗生素处理后金葡菌假定蛋白VraX的水平明显升高(>20倍)。本部分研究中,我们主要探索VraX参与金葡菌天然耐药的机制研究,具体内容如下：***蛋白与金葡菌的天然耐药明显相关：我们通过基因同源重组的方法获得了vraX基因的缺失突变株(△vrax)。药物敏感性检测实验结果表明△vraX对多种抗生素敏感。2. rnaseⅲ调控金葡菌中vraX的水平：我们通过RNA-pulldown实验中证实rnaseⅲ能够结合vraX,基因芯片对比分析发现△rnaseⅲ中vraX的水平明显升高,我们利用RT-PCR及qRT-PCR验证这一结果。进一步的凝胶阻滞实验证实rnaseⅲ可以特异的结合vraX。同时降解实验表明,在Mg2+存在的条件下vraX可以被rnaseⅲ特异的降解。我们的结果提示rnaseⅲ能够结合并降解vraX。综上所述,我们发现金葡菌中的TRAP蛋白可以通过与FadD蛋白相互作用参与亚油酸对金葡菌的杀伤。同时,我们的研究结果表明VraX蛋白可能参与了金葡菌的天然耐药,并且rnaseⅲ可以影响其水平。以上研究将为抗金葡菌感染研究提供可能的药物靶点以及新的理论基础。本文图87幅,表2个,参考文献61篇。

关键词：金黄色葡萄球菌亚油酸 TRAP FadD 天然耐药 VraX rnaseⅲ

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拟南芥耐逆突变体的筛选及鉴定

拟南芥耐逆突变体的筛选及鉴定

作者：蒋春云山东师范大学

学位级别：硕士

盐胁迫作为非生物胁迫因子,严重影响植物的生长、发育、产量等,随着土壤盐渍化的日益严重,以及世界人口的不断增加,粮食的供给越来越紧张,因此如何开发利用盐渍化土地以及如何提高作物的产量是世界农业生产中的重要问题之一。拟南芥因... 详细信息

盐胁迫作为非生物胁迫因子,严重影响植物的生长、发育、产量等,随着土壤盐渍化的日益严重,以及世界人口的不断增加,粮食的供给越来越紧张,因此如何开发利用盐渍化土地以及如何提高作物的产量是世界农业生产中的重要问题之一。拟南芥因具有许多特殊的生物学及遗传学特征,使其在近些年以来成为研究植物基因功能的模式生物,在研究植物的耐盐方面也起到了非常重要的作用,目前提高植物胁迫耐性的遗传方法为,通过将新基因转入植物或改变植物现有基因的表达水平影响抗盐性程度,培育转基因抗盐植物。目前世界上已经通过各种方法建立了拟南芥的突变体库,为拟南芥基因的功能研究提供了良好的条件。本实验以组成型激活标签突变体库和诱导型激活标签突变体库为基础,进行了拟南芥耐盐突变体的筛选,目的在于获得耐盐突变体并克隆相关耐盐基因。rnase的主要生理功能是控制细胞内RNA的种类与数量分布,除参与核糖核酸转录后的剪切、修饰和降解等过程外,还与某些植物的自交不亲和性、器官发生、宿主的防御机制,控制肿瘤血管生成、杀灭肿瘤细胞及抑制病毒复制等有关。研究表明,大肠杆菌中YmdB基因在受到冷胁迫时可以抑制rnaseⅲ的活性,因此本实验对拟南芥中YmdB的同源基因AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310进行了初步研究,通过TAIR网站购买得到特定位点突变的突变体,对其进行了表型分析和基因的功能研究。目的在于探究这三个基因在受到逆境胁迫时的表型以及与rnaseⅲ活性的关系。在对AT1G69340基因的突变体胚胎发育的研究中发现,其可能为胚胎致死突变体,目前已报道拟南芥中有许多参与种子胚发育的基因与基因印迹有关,如SIN1、FIS1、MEA等。研究表明,MEA在胚胎形成之前（花发育期）不表达,在含有成熟配子的未受精的果荚中开始表达,在种子成熟后停止表达,受精后MEA的表达受基因组印迹的调控,父体来源的基因拷贝并不能减少胚胎致死。另外,父体来源的基因只在胚乳中沉默,在营养器官中不沉默。并且,母体效应基因对胚胎发育的影响与父体来源的基因的剂量无关,不论父体来源的基因剂量如何都不能改变母体效应基因对胚胎发育的控制。本实验的主要目的在于获得拟南芥耐盐突变体以及对AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310基因的突变体的表型分析和基因的功能研究。主要结果如下:1.对T-DNA插入组成型串联增强子激活标签突变体库的4200个株系和诱导型激活标签突变体库的4100个株系的筛选,以及对初步筛选得到的56株突变体的后代进一步验证,未得到可稳定遗传的耐盐突变体。2.对突变体CS808255、CS839860（T-DNA插入位点为AT1G69340）,CS830160、CS823606（T-DNA插入位点为AT2G40600）,Salk24760c、Salk80565c（T-DNA插入位点为AT5G01310）进行了插入位点基因型的鉴定,除CS808255、CS839860外其他均得到纯合植株。3.构建了基因AT1G69340、AT2G40600的GUS、GFP表达载体,并进行了花序侵染,已收获种子。4.对突变体CS808255、CS839860进行了种子的胚胎发育的观察研究并对其花粉进行了染色和活力测定,结果显示,突变体的种子在开花后8-9d时的胚胎发育略滞后于野生型种子的胚,并且突变体与野生型的花粉活力和萌发情况相似,基本没有区别。5.用实时定量PCR的方法观察了在不同胁迫条件处理下拟南芥叶中基因AT1G69340、AT2G40600、AT5G01310的表达变化,结果显示除300mM甘露醇处理3h以及38℃3h后转移至25℃4h这两种处理时基因AT5G01310的表达明显上升外,其他均无明显变化。

关键词：拟南芥耐盐突变体 rnaseⅲ 胚胎发育功能研究