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Human cytomegalovirus rna2.7 inhibits rna polymeraseⅡ(PolⅡ)Serine-2 phosphorylation by reducing the interaction between PolⅡand phosphorylated cyclin-dependent kinase 9(pCDK9)

引用

Virologica Sinica 2022年第3期37卷 358-369页

作者： Yujing Huang Xin Guo Jing Zhang Jianming Li Mingyi Xu Qing Wang Zhongyang Liu Yanping Ma Ying Qi Qiang Ruan Virology Laboratory Shengjing Hospital of China Medical UniversityShenyang110004China Department of Pediatrics Shengjing Hospital of China Medical UniversityShenyang110004China Department of Obstetrics and Gynecology Shengjing Hospital of China Medical UniversityShenyang110004China Department of Pediatrics The Fourth Affiliated HospitalChina Medical UniversityShenyang110033China

Human cytomegalovirus(HCMV)is a ubiquitous pathogen belongs to betaherpesvirus ***2.7 is a highly conserved long non-coding rna accounting for more than 20%of total viral *** our study,functions of HCMV rna2.7 were investigated by comparison of host cellular transcriptomes between cells infected with HCMV clinical strain and rna2.7 deleted *** was demonstrated that rna polymeraseⅡ(PolⅡ)-dependent host gene transcriptions were significantly activated when rna2.7 was removed during infection.A145 nt-in-length motif within rna2.7 was identified to inhibit the phosphorylation of PolⅡSerine-2(PolⅡS2)by reducing the interaction between PolⅡand phosphorylated cyclin-dependent kinase 9(pCDK9).Due to the loss of PolⅡS2 phosphorylation,cellular DNA pre-replication complex(pre-RC)factors,including Cdt1 and Cdc6,were significantly decreased,which prevented more cells from entering into S phase and facilitated viral DNA *** results provide new insights of HCMV rna2.7 functions in regulation of host cellular transcription.

关键词： Human cytomegalovirus(HCMV) rna2.7 rna polymeraseⅡ(PolⅡ) Cyclin-dependent kinase 9(CDK9) Phosphorylation

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人巨细胞病毒rna2.7对宿主细胞Ⅱ型干扰素通路调控作用的研究

人巨细胞病毒RNA2.7对宿主细胞Ⅱ型干扰素通路调控作用的研究

引用

作者：许鸣一中国医科大学

学位级别：硕士

目的:研究人巨细胞病毒（Human cytomegalovirus,HCMV）长链非编码rna rna2.7的生物学功能及其相关机制。研究方法:对HCMV临床低传代分离株HAN-BAC及rna2.7缺失突变株HANΔrna2.7-BAC感染人胚肺成纤维细胞（Human embryonic lung fibroblast,HELF）进行全转录组测序。通过对不同毒株感染细胞转录组差异基因的比较分析,探寻rna2.7在HCMV感染过程中发挥的生物学功能。采用体外转染、Western Blot及实时荧光定量PCR等方法检测HCMV rna2.7对宿主细胞Ⅱ型干扰素（Interferon,IFN）通路关键激酶信号转导与转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1,STAT1）蛋白磷酸化水平及STAT1下游干扰素刺激基因（Interferon stimulated genes,ISGs）转录活性的调控作用,探讨其发挥调控功能的可能分子机制。结果:1)对不同感染组转录差异基因进行基于Gene Ontology及KEGG数据库的富集分析,结果显示:HAN-BAC感染组与未感染组的差异基因显著富集于IFN信号及对病毒感染应答等通路中;该富集现象未出现在HANΔrna2.7-BAC感染组与未感染组差异基因的分析结果中,提示HCMV rna2.7可能在感染过程中参与宿主细胞干扰素信号通路的调控。2)干扰素信号通路的信号转导是通过酪氨酸激酶1（Janus kinase 1,JAK1）与STAT1蛋白的磷酸化级联传递实现的。Western Blot结果显示:相较于HAN-BAC感染细胞,HANΔrna2.7-BAC感染细胞中磷酸化STAT1（p-STAT1）蛋白表达水平显著升高两倍以上,而STAT1与磷酸化JAK1（p-JAK1）蛋白水平则无明显差异,提示HCMV rna2.7在HCMV感染过程中抑制了干扰素通路中STAT1的磷酸化。3)通过体外转染在人胚胎肾细胞293（Human embryonic kidney 293,HEK293）中转录rna2.7。使用IFN分别刺激HEK293细胞及外源性转录rna2.7的HEK293细胞,分别检测STAT1和p-STAT1蛋白的表达水平。结果显示:IFN处理条件下,rna2.7可显著降低宿主细胞中p-STAT1水平约三倍,而STAT1蛋白水平未受影响,提示在无其它病毒组分参与条件下,rna2.7可以抑制Ⅱ型干扰素通路中STAT1的磷酸化。4)既往研究证实,蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-2（Protein phosphotyrosine phosphatase SHP-2,SHP2）可以特异性降低STAT1的磷酸化水平。采用SHP2抑制剂Sodium Stibogluconate分别处理经IFN刺激的HEK293细胞和外源性转录rna2.7的HEK293细胞,检测STAT1和p-STAT1蛋白的表达水平。结果显示:SHP2抑制剂对不同处理组细胞中p-STAT1与STAT1的蛋白水平无显著影响,提示rna2.7对Ⅱ型干扰素通路中STAT1磷酸化的抑制作用并不是通过增强SHP2的磷酸酶活性实现的。5)采用IFN分别刺激HEK293细胞和外源性转录rna2.7的HEK293细胞,检测ISGs的转录水平。结果显示:rna2.7可显著降低Ⅱ型干扰素通路中ISGs基因的转录水平,提示rna2.7通过抑制STAT1的磷酸化水平降低宿主细胞Ⅱ型干扰素通路下游ISGs基因的转录,进而影响宿主细胞对Ⅱ型干扰素通路的应答水平。结论:在HCMV感染过程中,HCMV rna2.7抑制了宿主细胞Ⅱ型干扰素信号通路中STAT1的磷酸化水平及其下游ISGs基因的转录水平。HCMV rna 2.7对Ⅱ型干扰素通路中STAT1磷酸化的抑制作用是独立且非病毒组分依赖的。HCMV rna2.7对Ⅱ型干扰素通路中STAT1磷酸化的抑制作用不是通过增强SHP2的去磷酸化作用实现的。

关键词：人巨细胞病毒 rna2.7 Ⅱ型干扰素信号通路 STAT1 磷酸化

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