检索结果-南通市图书馆

作者：宾浪漫湘潭大学

学位级别：硕士

随着新一代高通量测序技术的迅猛发展,rna-seq技术已成为目前转录组研究的重要手段,而转录组测序深度直接影响表达基因的检测。本文基于rnaseq测序技术,研究了测序深度对表达基因检测的影响,为不同研究目的而选择合适的测序深度提供了... 详细信息

随着新一代高通量测序技术的迅猛发展,rna-seq技术已成为目前转录组研究的重要手段,而转录组测序深度直接影响表达基因的检测。本文基于rnaseq测序技术,研究了测序深度对表达基因检测的影响,为不同研究目的而选择合适的测序深度提供了参考。本文以人类脑组织的转录组测序数据为分析材料,建立了完整的rna-seq数据分析流程,首先对FASTQ格式的测序数据进行质量评估和过滤处理,然后从过滤后的数据中随机取样,模拟构建了不同测序深度的文库,最后分析了所有数据,并比较分析了不同测序深度下检测到的基因数量的变化。研究发现,随着测序深度的增加,检测到的基因数量也随之增加,但新增检出的基因个数随着测序深度的增加而逐渐减小,两者并不是简单的线性关系,其关系形如:y=a·log2(x+b)+c,其中,x,y分别表示测序深度和检出的基因数,a,b,c为常系数。同时,本文还讨论了测序深度对检测转录因子、长链非编码rna表达的影响。

关键词： rna-seq技术测序深度表达基因数量转录因子长链非编码rna

强直性脊柱炎患者外周血microrna表达谱的研究

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强直性脊柱炎患者外周血microRNA表达谱的研究

作者：吕颖第二军医大学

学位级别：硕士

强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一种与人类白细胞相关抗原B27分子（HLA-B27）相关的炎症性的脊柱及关节病变，主要侵犯中轴关节，几乎全部累及骶髂关节和不同程度累及外周关节，炎症可侵犯滑膜关节、关节软骨以及肌腱、韧... 详细信息

强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)是一种与人类白细胞相关抗原B27分子（HLA-B27）相关的炎症性的脊柱及关节病变，主要侵犯中轴关节，几乎全部累及骶髂关节和不同程度累及外周关节，炎症可侵犯滑膜关节、关节软骨以及肌腱、韧带和韧带附着点，常引起纤维性和骨性强直。中国人的发病率约为0.3%。AS病因及发病机制目前尚不明确,其发生可能与遗传、慢性炎症、自身免疫功能紊乱等因素有关。目前认为T淋巴细胞的功能失调在AS发病中起着核心作用,尤其是辅助性T细胞(Th细胞)，控制着其他淋巴细胞的活性及适应性免疫应答的诸多方面。研究指出mirna在建立、维持淋巴细胞身份及免疫调控中起到至关重要的作用。目的：分析强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis，AS)患者外周血单个核细胞中（Peripheral Blood Mononuclear Cell，PBMC）中mirna的表达情况，筛选与AS发病可能相关的mirna，分析mirna对靶基因的调控作用，明确信号通路，初步探讨mirna在其发病机制中的作用。方法：我们分别取3例AS患者及健康对照的外周血，分离PBMC，提取mirna，运用全基因组Solexa测序扫描，根据Prna的表达差异，同时在30例AS患者及30例健康对照中运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）方法对差异mirna进行验证。所有AS患者诊断均符合美国风湿病学会（ACR）1984年修订的纽约标准，同时满足HLA-B27阳性、BASDAI>4的入组条件。结果：根据Prna表达显著差异（prna进行实时定量PCR验证，结果发现这11种mirna基因在患者中均表达下调。进行差异表达mirna靶基因预测发现这些mirna与ERAP1、STAT3、IGSF、IL17、IL2、IL22、IL23、IL24、IRAK、MAPK、TNF和TOLLIP具有相关性。结论：AS患者PBMC中的mirna可能通过影响ERAP1、STAT3、IGSF、IL17、IL2、IL22、IL23、IL24、IRAK、MAPK、TNF和TOLLIP的表达从而参与AS的发病机制，同时通过测定mirna的表达或许可以为临床上AS的早期诊断提供潜在的诊断标志物。

关键词： AS rna-seq技术 mirna

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甘蓝型油菜表面角质脂类成分研究

甘蓝型油菜表面角质脂类成分研究

作者：胡新鸽华中农业大学

学位级别：硕士

角质层是保护植物适应外界胁迫的屏障,与植物的抗逆性有密切关系,角质是角质层的主要成分,也是角质层的基本结构,通过对角质的研究有助于阐明角质层形成和调控的分子机制,为角质层的功能研究奠定基础。本研究优化了油菜角质提取的方法,... 详细信息

角质层是保护植物适应外界胁迫的屏障,与植物的抗逆性有密切关系,角质是角质层的主要成分,也是角质层的基本结构,通过对角质的研究有助于阐明角质层形成和调控的分子机制,为角质层的功能研究奠定基础。本研究优化了油菜角质提取的方法,通过气相色谱-质谱技术(Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)技术分析鉴定角质含量与成分,比较了两种环境下生长的油菜角质含量与成分的差异和油菜不同组织(茎,叶片,角果)中角质含量的差异,研究不同程度的干旱胁迫对8个抗旱性存在显著差异的油菜品种叶片角质的影响,并进行rna-seq测序检测油菜不同组织(根,茎,叶片,花,角果,种子)和干旱胁迫下的基因表达量,分析角质基因表达量,筛选出角质基因,并分析了398个油菜品种的角质含量与成分。主要研究结果如下:甲醇-浓硫酸-氯仿这种裂解液效果最好,分离鉴定出的角质单体成分最多,角质单体总量高于其他3种方法,适合用于油菜角质提取。实验田种植的油菜叶片的角质成分较为全面,且大多数角质成分的相对含量高于温室的。在中双11号油菜的角果,茎和叶片检测到81个角质单体,角果,茎和叶片中角质成分相对含量最高的都是2-hydroxy-Tetracosanoic acid。其中Tetradecanoic acid、14-methyl-pentadecanoic acid、2-hydroxy-Tetracosanoic acid、hexadecanoic acid、20-methyl-2-hydroxy-docosanoic acid 5种角质成分相对含量在角果,茎和叶片中差异较大。采用rna-seq测序技术分析中双11号油菜不同组织中基因表达量,经过对118个角质合成相关的基因表达情况的分析,结果表明有6个基因在不同组织中均无表达。BnaA05g09070D只在种子中特异性表达,BnaC05g04230D只在花中特异性表达。其中BnaCnng13910D在根中和叶片中的表达量最高,BnaA04g20340D在花中的表达量最高,BnaC04g51420D在茎中的表达量最高,BnaA02g32750D在角果和种子中的表达量最高。比较8个油菜品种在不同干旱条件下角质含量。随着干旱胁迫程度的加深,与对照组相比,干旱胁迫组的角质总量呈现升高的趋势,而且在这8个品种中有27个角质成分的相对含量呈现显著性差异变化。分析中双11号油菜在干旱胁迫不同时间段(0h,1h,8h)的118个角质合成相关的基因表达量,有108个差异基因,其中有7个基因差异性显著,4个基因表达量显著上升,3个基因表达量显著下降。已经对398个品种油菜角质含量,成分进行分析,下一步对角质成分做全基因组关联分析(Genome-wide association studies,GWAS)分析来定位一些与角质合成相关的位点。

关键词：甘蓝型油菜角质 GC-MS分析技术 rna-seq技术抗旱性

不同季节牦牛机体棕色脂肪组织相关基因表达差异及其脂肪酸组成成分的比较

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不同季节牦牛机体棕色脂肪组织相关基因表达差异及其脂肪酸组成成...

作者：谢凤莲青海大学

学位级别：硕士

棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)利用脂肪酸作为代谢底物,通过β氧化和解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的去耦作用在线粒体中产生热量,燃烧脂肪。目前,关于BAT研究主要集中于人和小型哺乳动物,而在较大的动物身上鲜有... 详细信息

棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)利用脂肪酸作为代谢底物,通过β氧化和解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的去耦作用在线粒体中产生热量,燃烧脂肪。目前,关于BAT研究主要集中于人和小型哺乳动物,而在较大的动物身上鲜有报道。长期在高原环境下生活的牦牛拥有耐寒的独特体质,使牦牛成为探究动物机体对寒冷环境适应性机制最佳的研究对象。因此,本试验针对不同季节牦牛机体棕色脂肪组织相关基因差异表达和其脂肪酸成分是否有关联,随机选取冷季(一月)和暖季(十月)的放牧成年牦牛脊椎、肩胛、皮下、肾脏周围、腹部五个脂肪组织作为试验材料,开展免疫组化、Western blotting、Real-time PCR、rna-seq技术以及测定脂肪酸成分一系列的研究,从分子角度揭示牦牛机体棕色脂肪,并为牦牛在寒冷环境下生存的机理提供基础数据。研究结果如下:(1)UCP1蛋白表达和基因相对表达量:利用免疫组化和Western blotting检测得到UCP1蛋白在不同季节牦牛五个脂肪组织中均有表达,且在皮下脂肪、肩胛、肾脏脂肪组织中表达较高,差异显著(Prna-seq技术分析差异基因:筛选得到不同季节牦牛脊椎脂肪组织中上调基因有2305个,下调基因有2364个,两组之间共有差异基因有13236个。较暖季,冷季牦牛脊椎组织中UCP1、COX1、CEBPA、FABP4、PPARG等基因显著上调,PRDM16、ATP2A2、BMP7、FADS1等基因显著下调。育肥牦牛样品中上调基因有1158个,下调基因共有731个,共有差异基因有13696个。较放牧,育肥牦牛脊椎组织中SPP1、UCP2、CEBPA等基因显著上调,UCP1、BMP7、ELOVL6、FASN等基因显著下调。因此,冷季牦牛脊椎脂肪组织中高表达的基因较暖季多,寒冷气候会影响牦牛脊椎脂肪组织基因的表达。育肥牦牛和放牧牦牛基因表达模式相近,仅有少数基因发生变化,比起育肥,寒冷环境更会影响牦牛机体内基因的表达。(3)GO富集分析:在不同季节牦牛脊椎脂肪组织差异基因GO富集条目是943个,主要富集在细胞组成,极显著富集在线粒体内膜、核糖体、线粒体。育肥牦牛脊椎脂肪组织差异基因富集1104个GO分类,主要显著富集在磷蛋白磷酸酶活性、水解酶活性,作用于酯键、蛋白酪氨酸磷酸酶活性等分子功能,细胞组成中富集最少。因此,寒冷季节会影响牦牛机体脂肪细胞的组成,但是育肥主要通过分子功能来调节牦牛机体的细胞活性。(4)KEGG富集分析:不同季品牦牛样品差异基因共参与304条通路,主要参与粘附斑激酶、氧化磷酸化、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、脂肪酸降解等23条通路。育肥样品共参与294条通路,主要参与溶酶体、吞噬体、类风湿性关节炎等27条通路。其中UCP1基因参与3条通路,分别为:Huntington’s disease、PPAR信号通路、Apelin信号通路。不同季节牦牛样品UCP1基因主要参与富集74个基因的Huntington’s disease代谢通路,而育肥牦牛样品中参与显著富集项是PPAR信号通路,共富集到19个基因。因此,寒冷环境和育肥会影响牦牛机体内部代谢途径的变化。(5)牦牛脂肪组织脂肪酸成分分析:不同季节牦牛各个脂肪组织中的脂肪酸主要以饱和脂肪酸为主,脂肪酸含量有明显差异。相比暖季,冷季随着牦牛各个脂肪组织中UCP1基因相对表达量的变化,其脂肪酸PUFA、C、MUFA、C、C含量也会变化。牦牛不同脂肪组织中检测到BCFA,除肩胛外,其余组织中冷季BCFA含量低于暖季,且UCP1基因相对表达量越高的组织BCFA含量越低。因此,说明牦牛在寒冷季节,随着牦牛脂肪组织中其脂肪酸C、BCFA、CC等脂肪酸含量的变化,会影响UCP1基因相对表达量的变化,具体影响机制需要进一步研究。

关键词：牦牛棕色脂肪组织解耦联蛋白1 基因表达 rna-seq技术脂肪酸

帕金森病患者外周血circrna的测序研究

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帕金森病患者外周血circRNA的测序研究

作者：孔凡丛济宁医学院

学位级别：硕士

目的:通过测序技术分析帕金森病患者与正常对照组在外周血中circrna的表达,比较两者间的差异表达水平,探讨显著差异表达的circrna及其可能的信号通路和对应的靶基因,深入了解circrna在帕金森病发病机制中的作用,为寻找帕金森病的诊断标... 详细信息

目的:通过测序技术分析帕金森病患者与正常对照组在外周血中circrna的表达,比较两者间的差异表达水平,探讨显著差异表达的circrna及其可能的信号通路和对应的靶基因,深入了解circrna在帕金森病发病机制中的作用,为寻找帕金森病的诊断标志物提供新的研究方向。方法:将帕金森病患者(n=4)与正常对照(n=4)作为研究对象进行分组,分别收集两组的外周静脉血,根据PAXgene Blood rna Kit操作手册提取、纯化rna,通过NanoDrop 2000和Agilent2100检测rna浓度及完整性。利用rna测序技术分析mrna和circrna的表达情况并进行筛选。通过使用热图、火山图呈现显著差异表达的mrna和circrna。GO和KEGG富集分析显著差异表达的mrna,从中获取与帕金森病发生发展相关的信号通路和靶基因。用miRTarBase数据库软件预测circrna与mirna的结合位点,TargetScan数据库软件预测mrna与mirna的结合位点,以此构建cerna网络,探究circrna在帕金森病中的生物学功能。同时,对显著差异表达的circrna使用qRT-PCR的方法进行进一步验证。结果:在帕金森病患者和正常对照的外周血中检测mrna和circrna,其中有766个mrnas和411个circrnas被鉴定为显著差异表达。与正常对照组相比,帕金森病患者中有273个mrnas表达上调、493个mrnas表达下调。另外,对circrna的表达进行分析发现与正常对照组相比,帕金森病患者中有129个circrnas表达上调、282个circrnas表达下调。经过mrna在KEGG富集分析中发现帕金森病的表达通路位于第二位,并发现帕金森病患者中差异表达的mrna与线粒体呼吸链功能障碍具有相关性。cerna网络包括10个差异表达的mrnas,13个预测的mirnas和10个差异表达的circrnas。8个显著差异表达的circrna进行qRT-PCR验证发现hsairc009190具有统计学差异(Prna。circrna与mirna结合发挥海绵作用,可能在帕金森病基因表达调控中起重要作用。根据GO、KEGG富集和cerna网络分析发现线粒体呼吸链功能障碍与帕金森病密切相关。通过qRT-PCR验证提示hsairc009190可能与帕金森病具有相关性。

关键词：帕金森病 circrna cerna rna-seq技术生物标志物

p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活来促进B细胞...

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作者：孙传凯暨南大学

学位级别：硕士

原发性淋巴瘤（primary effusion lymphoma,PEL）是由卡波西肉瘤疱疹相关病毒（Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV）引起的B细胞淋巴瘤。目前,关于PEL的致瘤机制尚不清楚。相关研究已表明细胞转录共激活因子p300能够调节... 详细信息

原发性淋巴瘤（primary effusion lymphoma,PEL）是由卡波西肉瘤疱疹相关病毒（Kaposi’s Sarcoma-Associated Herpesvirus,KSHV）引起的B细胞淋巴瘤。目前,关于PEL的致瘤机制尚不清楚。相关研究已表明细胞转录共激活因子p300能够调节宿主与病毒之间的相互作用,从而控制病毒复制过程。在此项研究中,我们探索了p300在KSHV感染的BCBL1细胞中的功能。研究结果显示;（1）敲除p300能够导致KSHV早期裂解基因表达显着地增加,并促进BCBL1细胞增殖相关的基因表达;（2）敲除p300会显着抑制KSHV裂解态的激活即立即早期基因RTA和晚期裂解基因K8的大量表达;（3）敲除p300后细胞内的KSHV基因组拷贝数和病毒粒子的产量相应地减少;（4）p300基因的敲除抑制了KSHV感染的BCBL1细胞的生长。这些研究结果表明p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活来促进B淋巴瘤细胞增殖。目的:1.了解p300对KSHV感染的BCBL1增殖过程的影响以及KSHV基因表达的调控;2.探讨p300对BCBL1细胞中KSHV复制的影响;3.研究p300调控BCBL1细胞增殖的功能。方法:1.构建稳定敲除p300基因的细胞系a)建立稳定敲除p300基因的BCBL1细胞系本课题我们将用lenti CRISPR v2慢病毒敲除系统,设计含有靶向基因p300的sg rna,利用慢病毒包装系统转染到293T细胞中,然后收集慢病毒感染BCBL1细胞,最后使用嘌呤霉素（puromycin）筛选成稳定的细胞系。b)鉴定p300基因敲除稳定细胞系利用Western blot方法检测了BCBL1-sg rna细胞系中p300的表达。同时用q PCR技术检测相应的m rna表达水平,以确认细胞系中p300基因的敲除。2.用rna-seq技术对稳定敲除p300的细胞系进行分析使用BCBL1-sgctrl和BCBL1-sgp300细胞,对提取的rna进行高通量测序。3.检测p300被敲除后,探索对KSHV裂解复制的影响用TPA/SB诱导剂处理BCBL1-sgctrl和BCBL1-sgp300细胞5天,分别收取不同时间点的细胞和上清,提取细胞内和上清中病毒DNA,并用RT-q PCR检测KSHV基因组拷贝数的变化,确认p300对KSHV病毒复制的影响4.检测p300对BCBL1细胞增殖的影响使用台盼蓝和CFSE试剂在不同的时间点对细胞数目和增殖情况检测。结果:1.成功构建了p300基因敲除的稳定细胞系并获得rna-seq数据。结果显示敲除p300能够导致KSHV早期裂解基因表达显着地增加,并促进BCBL1细胞增殖相关的基因表达。2.研究发现敲除p300会显着抑制KSHV裂解态的激活即立即早期基因RTA和晚期裂解基因K8的大量表达;敲除p300后细胞内的KSHV基因组拷贝数和病毒粒子的产量相应地减少。3.证明了p300能够影响KSHV感染的BCBL1的细胞增殖。结论:本研究结果综合表明p300通过抑制卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）再激活来促进B淋巴瘤细胞增殖,这为进一步阐释KSHV感染引起的PEL致癌机制提供了依据。

关键词：卡波西肉瘤相关疱疹病毒 p300 BCBL1 rna-seq技术

日本七鳃鳗鳃黏膜组织转录组学分析与VLRC分子多克隆抗体制备

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日本七鳃鳗鳃黏膜组织转录组学分析与VLRC分子多克隆抗体制备

作者：毕玉艳辽宁师范大学

学位级别：硕士

黏膜免疫系统是构成动物免疫系统的重要组成。七鳃鳗生活在水体中,其皮肤和鳃直接与水环境接触,因此鳃黏膜组织是七鳃鳗抵御感染的一道重要防线。为探索日本七鳃鳗鳃(Lampetra japonicus)黏膜免疫反应的遗传基础,本文利用第二代高通量... 详细信息

黏膜免疫系统是构成动物免疫系统的重要组成。七鳃鳗生活在水体中,其皮肤和鳃直接与水环境接触,因此鳃黏膜组织是七鳃鳗抵御感染的一道重要防线。为探索日本七鳃鳗鳃(Lampetra japonicus)黏膜免疫反应的遗传基础,本文利用第二代高通量转录组测序技术对日本七鳃鳗的鳃组织进行了高通量测序,通过生物信息学方法分析了被混合菌免疫刺激后,日本七鳃鳗与免疫相关分子的差异表达情况。结果表明:1.混合菌刺激后,鳃黏膜中与生理过程相关的一些分子相对表达量下调。这些分子包括:肌球蛋白轻链家族(myosin light chain 3,MYL)、肌球蛋白重链家族(MYH)、钙肌蛋白T家族(Troponin T,TNNT)等,说明感染病原菌后生物体呈现生理活性减低现象。2.与高等脊椎动物TCR信号通路相关信号分子的相对表达量上调。这些分子包括:有丝分裂原蛋白激酶p38(mitogen activated protein kinases p38,p38MAPK)、NCK衔接因子蛋白1(NCK Adaptor Protein 1,NCK)以及酪氨酸蛋白激酶Lck、Fyn和Tec,说明七鳃鳗鳃黏膜免疫系统的免疫应答反应存在与高等脊椎动物TCR信号通路相保守的分子基础。3.在七鳃鳗鳃黏膜系统中类T细胞表达的VLRA和VLRC受体数量和种类占优势,其中胚系VLRC的表达量有明显上调趋势,而具有功能性的VLRC也发生了从无到重排的变化,说明七鳃鳗鳃黏膜免疫系统主要以VLRA和VLRC两种了类T细胞受体的免疫应答反应为主。为深入研究VLRC在七鳃鳗免疫应答过程中的作用,本文制备了该分子的兔源多克隆抗体,为未来对其功能的深入研究奠定了基础。通过对多个VLRC蛋白序列进行同源比对,发现保守性较高的结构域为LRRCT(leucine-rich repeat C terminal)和LRRNT(leucine-rich repeat N terminal),其序列一致性分别为85%和63%。而通过在线网站预测VLRC分子的抗原表位,发现在所检测到的13个抗原表位中,位于LRRNT结构域第38-51个氨基酸处的肽段抗原性比较好,确定以LRRNT结构域为抗原肽段。接着对LRRNT序列构建表达载体进行诱导表达,发现在条件为37℃,IPTG浓度为1mmol/m L时诱导表达效果最好。对诱导后的蛋白进行纯化,将纯化后的可溶性蛋白LRRNT与佐剂混合制成抗原,对新西兰兔(Oryctolagus cuniculus)进行皮下多点免疫注射,经过4次加强免疫,最终获得效价高达1:128000的多克隆抗体。通过免疫印迹法对纯化后的抗体进行检测,发现所制备的多抗不仅可以识别重组蛋白而且可以在鳃组织所制备的样本中检测到天然VLRC受体蛋白。以上结果说明,本文所制备的VLRC多克隆抗体特异性较高,可以为后续的VLRC功能研究的顺利开展提供保障。

关键词：日本七鳃鳗 VLRC rna-seq技术抗体制备

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禽多杀性巴氏杆菌耐药株的转录组学分析

禽多杀性巴氏杆菌耐药株的转录组学分析

作者：孔令严安徽农业大学

学位级别：硕士

禽多杀性巴氏杆菌是一种严重危害养禽业的病原菌,能够引起家禽和野生鸟类禽霍乱。近年来由于养殖业的广泛且不合理的使用抗菌药物,禽多杀性巴氏杆菌的多重耐药现象日趋严重,导致患病家禽大批死亡,给养殖业造成巨大的经济损失。因此,开... 详细信息

禽多杀性巴氏杆菌是一种严重危害养禽业的病原菌,能够引起家禽和野生鸟类禽霍乱。近年来由于养殖业的广泛且不合理的使用抗菌药物,禽多杀性巴氏杆菌的多重耐药现象日趋严重,导致患病家禽大批死亡,给养殖业造成巨大的经济损失。因此,开展禽多杀性巴氏杆菌的耐药机制,寻找药物作用新靶点的研究具有重要意义。诸多研究表明禽多杀性巴氏杆菌临床分离株多呈现出对氨基糖苷类、四环素类、磺胺类和氟喹诺酮类等抗菌药物的多重耐药性,并且认为其耐药性的产生主要是由耐药质粒和药物作用靶位改变所导致,但是其确切的分子耐药机制尚不清楚。对此,本研究在人工体外诱导耐药菌株的基础上,从转录组层面进行禽多杀性巴氏杆菌对链霉素、环丙沙星和四环素的分子耐药机制初步探讨。主要研究内容与结果如下:首先,禽多杀性巴氏杆菌耐药菌株的体外诱导及其特性检测。将禽多杀性巴氏杆菌标准株C48-1接种含有1/2 MIC相应抗生素的TSA培养基中诱导培养至25代后,成功获得了高度耐药的Str菌株以及中度耐药的Cip和Tet菌株。与标准菌株相比,耐药菌株的生长速率和生理生化特性未发生明显改变,对多种抗菌药物的敏感度降低甚至转为耐药,并且在无抗性培养基中连续传代20代后仍具有稳定的耐药性。这些稳定的耐药菌株可用于转录组测序。其次,耐药菌株的转录组测序与生物信息学分析。提取标准菌株与耐药菌株总rna进行rna-seq测序,比较分析细菌诱导耐药前后基因表达的变化,并通过GO、KEGG和ARDB分析,探讨差异表达基因的功能及其涉及的代谢通路。结果显示:与标准菌株相比,Str菌株有625个差异表达基因,其中584个上调表达,41个下调表达。这些差异基因涉及11类分子功能、参与19个生物过程和84个代谢通路,经ARDB检索出主要为氨基糖苷转移酶类和外排泵类的9种耐药相关基因。Tet菌株有442个差异表达基因,其中103个上调表达,339个下调表达,其涉及12类分子功能、参与18个生物过程和90个代谢通路,经ARDB检索出主要为核糖体保护蛋白和外排泵类的4种耐药相关基因。Cip菌株有19个差异表达基因,其中15个上调表达,4个下调表达。这些差异基因涉及3类分子功能、参与8个生物过程和6个代谢通路,未检索出耐药相关基因。最后,差异表达基因的荧光定量PCR验证。从三组转录组测序数据中挑选10个差异表达基因,以16S rrna为内参基因,系列稀释的标准菌株cDNA为模板,通过SYBR Green实时荧光定量PCR对各基因的熔解曲线、扩增曲线和标准曲线进行分析。结果显示,各基因的熔解曲线峰形单一,反应特异性好,扩增曲线重复性较好,内参基因与各目的基因标准曲线的相关系数R均大于0.99,扩增效率E均在0.9-1.0之间且E值相差小于5%,CT值均在10-35以内,适合采用2法对差异基因进行mrna表达水平的检测。以适当稀释的检测样品为起始模板浓度,进行实时荧光定量PCR检测,根据2法分析各基因的相对表达量,发现三组差异基因的表达趋势与转录组测序结果一致。综上所述,本研究获得了3株稳定的耐药菌株(Tet、Str和Cip),初步认为耐药菌株Tet和Str 的多重耐药性主要是由多药外排泵ABC转运蛋白与核糖体保护蛋白的过量表达或氨基糖苷转移酶表达的协同作用所导致;Cip菌株的多重耐药性主要是由ABC转运蛋白的过量表达所引起。

关键词：禽多杀性巴氏杆菌人工体外诱导耐药性 rna-seq技术实时荧光定量PCR

RIG-1信号通路在乙脑病毒诱导细胞凋亡中的机制研究

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RIG-1信号通路在乙脑病毒诱导细胞凋亡中的机制研究

作者：高明星华中农业大学

学位级别：硕士

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)会对人和动物的中枢神经系统造成损伤,还会引起猪的生殖系统疾病。JEV穿过血脑屏障导致以神经元损伤为特征的病毒性脑炎(Japanese encephalitis,JE),给公共卫生安全带来严重的威胁。细胞... 详细信息

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)会对人和动物的中枢神经系统造成损伤,还会引起猪的生殖系统疾病。JEV穿过血脑屏障导致以神经元损伤为特征的病毒性脑炎(Japanese encephalitis,JE),给公共卫生安全带来严重的威胁。细胞凋亡是指由一系列基因激活和调控的一种主动的细胞死亡形式,对机体的发育以及维持机体的平衡起着至关重要的作用。细胞凋亡参与了JEV引起的神经元损伤,因此,探究JEV诱导细胞凋亡的机制,对缓解脑组织损伤具有重要意义。本研究利用rna-seq技术查找JEV感染小鼠脑组织在转录水平基因表达的差异,筛选与细胞凋亡相关的差异表达基因及信号通路,从细胞水平分析筛选出来的信号通路对小鼠小胶质细胞凋亡的调节作用,探究机体内信号通路对细胞凋亡的调节机制,为阐明JEV引起脑损伤的分子机制提供理论依据。主要研究结果:***感染脑组织的转录组差异分析本研究以10 PFU的JEV P3株感染6周龄BALB/C雌鼠,利用HE染色观察脑组织的病理学变化,结果显示,脑组织出现显著的炎性反应:胶质细胞增生,大脑神经元变性坏死及大量炎性细胞聚集在血管周围。通过免疫组织化学染色技术观察到大部分神经元细胞JEV抗原阳性。利用QPCR发现JEV感染组Bax m rna表达高于对照组,Bcl-2 m rna表达低于对照组。转录组分析共筛选到2468个差异表达基因,大多与信号转导、免疫反应相关。通过GO功能富集分析,这些基因参与病毒感染、先天免疫和宿主防御反应等有关的生物过程。通过KEGG富集分析,富集的通路直接或间接与抗病毒反应有关,显著富集通路有JAK-STAT信号通路、Toll-like受体信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路和细胞因子-细胞因子受体相互作用。选取8个差异基因,采用QPCR进行验证,证实与转录组分析结果一致。表明JEV感染后,会引起先天免疫反应和炎症反应的激活。***感染对小胶质细胞凋亡相关蛋白的影响利用KEGG富集分析,发现在体内有11种凋亡相关的信号通路响应了JEV感染,包括内质网中的蛋白质加工,NF-κB、JAK/STAT、趋化因子、RIG-1、中PI3K-Akt、P53、MAPK、Foxo、Ras和c AMP信号通路。光镜下JEV感染BV2细胞能引起明显的细胞病变。利用间接免疫荧光发现JEV感染可增加小胶质细胞的活化水平。通过Hoechst 33342染色显示JEV感染的细胞中可以发现细胞核固缩、染色变深的现象。用Western blot技术发现JEV感染组Bcl-2蛋白表达减少、Bax蛋白表达增加,同时JEV增加了细胞色素c的释放,上调凋亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9。以上结果表明:在感染晚期,JEV能够引起BV2细胞中线粒体依赖性凋亡反应的发生。3.干扰RIG-1表达对JEV复制及小胶质细胞凋亡的影响利用QPCR和Western blot技术发现JEV感染BV2细胞,RIG-1、MAVS、IKK?、p-TBK1、p-NF-κB(p-p65)和p-IRF3的蛋白表达水平在24 h和36 h升高随后逐渐降低;病毒蛋白在24 h和36 h表达不明显,在48 h和60 h水平升高;p-Akt、p-m TOR的表达在24 h先升高随后降低;p62蛋白表达水平逐渐升高;在感染后期MDM2蛋白表达水平降低以及p53蛋白水平升高。表明JEV会导致RIG-I信号通路和p53信号通路的激活,在感染早期会引起Akt/m TOR通路的激活。通过rna干扰方法,干扰BV2细胞内RIG-1蛋白的表达,发现促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-9表达减少,cleaved caspase-3表达显著减少(P<0.05)、抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著增多(P<0.05),并且病毒蛋白表达显著减少(P<0.05)。表明干扰RIG-1表达可以抑制病毒复制并且通过缓解线粒体功能紊乱来保证细胞的存活。根据研究结果得出以下结论:***感染使得小鼠出现典型的神经症状,与细胞凋亡并且引起神经元变性坏死密切相关。***在感染早期激活小鼠小胶质细胞中Akt/m TOR通路,触发生存信号。***-1信号通路通过线粒体依赖途径参与JEV诱导的细胞凋亡过程,干扰RIG-1表达导致JEV的复制减少。

关键词：乙脑病毒小鼠 BV2细胞细胞凋亡 RIG-1信号通路 rna-seq技术

“渝沃无核”沃柑的果实品质和遗传差异初步分析

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“渝沃无核”沃柑的果实品质和遗传差异初步分析

作者：彭洁西南大学

学位级别：硕士

沃柑由“坦普尔”桔橙和“丹西”红桔杂交得到,表现出高糖低酸、晚熟、丰产优质等特点,但其种子数较多,一定程度上影响消费者口感和市场接受度。为改良沃柑种子数多的缺点,国家果树种质重庆柑橘圃利用γ辐射获得的沃柑少核突变体“渝沃... 详细信息

沃柑由“坦普尔”桔橙和“丹西”红桔杂交得到,表现出高糖低酸、晚熟、丰产优质等特点,但其种子数较多,一定程度上影响消费者口感和市场接受度。为改良沃柑种子数多的缺点,国家果树种质重庆柑橘圃利用γ辐射获得的沃柑少核突变体“渝沃无核”,其种子数量大幅减少。另外以色列也利用辐射诱变获得过无核沃柑,不仅种子数量大为减少,但同时也出现座果率低、易产生大小不整齐果实的问题。本研究拟通过比较沃柑及其少核/无核沃柑突变株的果实品质,同时结合测序技术,从分子水平上解析造成‘渝沃无核’少核、花期座果率较低等表型差异的主要遗传因素,对后续沃柑的遗传改良和生产具有重要意义。主要研究结果如下:1、果实品质比较以普通沃柑、091无核沃柑和“渝沃无核”的果实为实验材料,测定果实品质。（1）在种子数量上,“渝沃无核”的种子数量显著少于普通沃柑,相较于091无核沃柑无显著差异,2020年平均种子数量比2019年高。（2）在果实品质上,相比普通沃柑,“渝沃无核”和091无核沃柑的成熟期提前、果皮变厚、较难剥皮,同时三个品种在果实发育后期可溶性固形物、抗坏血酸含量、还原糖含量、转化糖含量、固酸比上升,可滴定酸含量下降,其中“渝沃无核”的可溶性固形物、固酸比和抗坏血酸含量最高,可滴定酸、转化糖含量最低。2、全基因组重测序比较以普通沃柑和“渝沃无核”的成熟叶片为材料,进行基因组测序分析。（1）“渝沃无核”的串联重复序列在基因组上的比例是3.44%,约为普通沃柑（7.46%）的一半。（2）对串联重复序列所在位置的基因进行GO功能富集,主要涉及代谢和生物合成,且普通沃柑相关基因只涉及小分子绑定、rna绑定,“渝沃无核”只涉及rna聚合酶活性、与物质的跨膜运动有关的ATPase活性。（3）KEGG通路富集主要涉及代谢过程和次生代谢物合成,且普通沃柑只涉及胞吞过程、同源重组,“渝沃无核”只涉及半乳糖代谢和过氧化物酶体相关途径存在差异。3、叶片的转录组比较以普通沃柑和“渝沃无核”的春季幼叶为材料,利用rna-seq技术进行测序分析。（1）共鉴定出3493个差异表达基因（DEGs）,GO功能注释主要涉及DNA代谢过程、染色体结构、微管基础过程;（3）KEGG通路注释主要涉及DNA复制、蜡质合成和错配修复,其中与蔗糖合成的相关基因在“渝沃无核”中上调表达。4、花期子房的转录组比较以普通沃柑和“渝沃无核”的花期子房为材料,利用rna-seq技术进行测序分析。（1）在“渝沃无核”和沃柑之间存在4140个DEGs,GO功能富集主要涉及碳水化合物代谢过程、氧化还原过程、β-半乳糖苷酶复合物,（2）KEGG通路富集主要涉及苯丙素生物合成、内质网蛋白加工和次生代谢物合成,其中与β-葡萄糖苷酶、过氧化物酶、热休克蛋白、黄酮醇合成酶、生长素早期生长响应相关的DEGs在“渝沃无核”中多数下调表达,花粉相关的G型受体激酶基因上调表达。

关键词： “渝沃无核” 果实品质 rna-seq技术全基因组重测序遗传差异