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中国人兽共患病学报 2022年第6期38卷 490-495页

作者：寇永杰李瑞郑亚东夏天奇时恒枝王璞杨兴孙晓林甘肃农业大学动物医学院兰州730030 浙江省绿色生态健康畜牧业应用技术重点实验室浙江省动物卫生检验与互联网技术工程实验室浙江省兽药与健康管理国际科技合作基地浙江农林大学动物科技学院动物医学院中澳动物健康大数据分析联合实验室杭州311300 大理学院基础医学院大理671000

目的通过扩增多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)rna结合蛋白28(RBP28)基因并构建重组表达质粒,诱导表达并纯化重组RBP28蛋白,探索多房棘球绦虫RBP28的分子特征。方法根据WormBase数据库RBP28基因序列设计特异性引物;RT-PCR扩增... 详细信息

目的通过扩增多房棘球绦虫(Echinococcus multilocularis)rna结合蛋白28(RBP28)基因并构建重组表达质粒,诱导表达并纯化重组RBP28蛋白,探索多房棘球绦虫RBP28的分子特征。方法根据WormBase数据库RBP28基因序列设计特异性引物;RT-PCR扩增RBP28基因并构建重组表达质粒,诱导表达并纯化重组RBP28蛋白,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;用Western blot检测多克隆抗体特异性,并通过免疫荧光观察RBP28在多房棘球蚴及其细胞中的分布;利用免疫共沉淀技术,获得与RBP28互作的蛋白沉淀产物后,对二者进行蛋白银染和质谱鉴定。结果RBP28编码基因大小约为1245bp;重组RBP28相对分子质量约为M_(r)50000;Western blot结果表明,多克隆抗体能够特异性识别重组蛋白RBP28及多房棘球蚴全蛋白中的天然RBP28蛋白,但与猪带绦虫、泡状带绦虫和细粒棘球绦虫无明显的抗原交叉反应;免疫荧光定位表明,RBP28主要分布在多房棘球蚴的生发层,在多房棘球蚴细胞则主要分布于细胞质中;对银染和质谱鉴定结果比较分析,获得了7种可能与RBP28相互作用的蛋白质。结论本研究确定了RBP28蛋白编码基因的大小、分子量及其多克隆抗体的特异性。通过免疫荧光定位,发现RBP28主要分布在多房棘球蚴的生发层,并利用质谱鉴定获得了7种与RBP28有互相作用的蛋白质,为研究多房棘球绦虫病的致病机制奠定了基础。

关键词：多房棘球蚴 rna结合蛋白28 免疫荧光定位免疫共沉淀质谱

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多房棘球绦虫rna结合蛋白28分子特征分析

多房棘球绦虫RNA结合蛋白28分子特征分析

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作者：寇永杰甘肃农业大学

学位级别：硕士

多房棘球蚴病,亦称泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE),是由多房棘球绦虫的中绦期幼虫-多房棘球蚴寄生所致,该虫体不仅在啮齿动物中也可在人的肺脏、肝脏等组织器官中寄生,引起的人兽共患病。多房棘球蚴感染的危害主要包括:机械性压... 详细信息

多房棘球蚴病,亦称泡球蚴病(alveolar echinococcosis,AE),是由多房棘球绦虫的中绦期幼虫-多房棘球蚴寄生所致,该虫体不仅在啮齿动物中也可在人的肺脏、肝脏等组织器官中寄生,引起的人兽共患病。多房棘球蚴感染的危害主要包括:机械性压迫,浸润性生长和组织毒性损伤,其病灶在肝脏组织最多且最典型。由于病程缓慢,潜伏期长和难以根除等多种因素,对该病的预防和控制仍有较大难度。rna结合蛋白是一类具有rna结合能力的蛋白质总称,其结构域能够特异性识别和结合不同类型的靶向rna分子。核糖核酸结合蛋白(RBPs)伴随着rna分子的合成,转运和分解及功能实现等生物过程,为确保生物体内rna功能的发挥,具有不可忽视的作用。研究发现,RBPs不仅与rna之间关系十分密切,而且在各个物种的生长发育,物质代谢和疾病发生的过程中同样占有这重要地位。虽然人们对多个物种RBPs的生物功能进行了广泛的了解和不断深入的研究,但是对多房棘球绦虫RBPs的研究仍然较少。本研究通过对多房棘球绦虫rna结合蛋白28基因序列分析发现,rna结合蛋白28是一种多房棘球绦虫所特有的rna结合蛋白。因此,为了对多房棘球蚴RBP28的生物学特性和功能进行相关探索,以下为主要得研究内容与结果。1.多房棘球绦虫RBP28的基因生物信息学分析。从Worm Base基因数据库中查询得知多房棘球绦虫RBP28的ORF全长1245 bp,编码414个氨基酸。通过Basic local alignment search tool(BLAST)与不同的寄生虫中的rna结合蛋白28基因序列进行对照分析。结果表明,近些年寄生虫在进化过程中RBP28却较为保守,可能在扁形动物出现之前就已存在,并且在进化过程中存在差异。多房棘球绦虫与细粒棘球绦虫的遗传距离为100,提示RBP28在棘球绦虫中进化保守。2.多房棘球绦虫RBP28蛋白原核表达和多克隆抗体制备。将RBP28基因使用RT-PCR的方法扩增,随后将产物与p ET-28a载体进行连接,并对双酶切结果进行鉴定。对构建成功的p ET-28a-RBP28质粒进行诱导表达。再以重组RBP28蛋白作为抗原,背部皮下多点注射免疫新西兰大白兔,当间接ELISA检测兔血清中的抗体效价达到1:102400时,收集兔血清,制备并纯化RBP28多克隆抗体,Western-bloting检测结果表明,制备的RBP28多克隆抗体能够特异性识别重组RBP28和多房棘球蚴全蛋白中天然RBP28蛋白。3.利用间接免疫荧光观察RBP28在虫体和细胞的分布特征。分离小鼠肝脏上的多房棘球蚴包囊,制备包囊切片,经脱蜡处理,使用3%双氧水进行抗原修复,利用0.25%的Triton X 100通化组织,FITC标记的山羊抗兔Ig G进行孵育。使用DAPI染色,随后使用中性树脂封片后,在免疫荧光显微镜下观察。结果发现RBP28主要分布于包囊的生发层。将分离的包囊用含有胰酶的PBS消化,置于6孔细胞培养板中进行贴壁培养,经0.25%Triton X-100处理。加入制备的RBP28多克隆抗体在4℃下孵育过夜。再加入Alexa Fluor 594标记的山羊抗家兔Ig G,并用DAPI染色液后封片。使用激光共聚焦显微镜观察并发现RBP28蛋白主要分布于多房棘球蚴虫体细胞细胞质中。4.免疫共沉淀及其复合物的银染与质谱鉴定。利用RBP28多克隆抗体与阴性血清分别对多房棘球蚴全蛋白进行免疫共沉淀。将免疫共沉淀复合物进行蛋白银染和质谱鉴定。通过银染与质谱鉴定,初步筛选出7种虫体蛋白,可能与RBP28存在互作关系。5.利用生物素标记技术探究RBP28与虫体总rna的结合。对多房棘球蚴总rna进行生物素标记。将标记好的rna与RBP28在一定条件下孵育结合,PAGE电泳检测二者的结合能力。结果表明RPB28具备与rna分子结合的能力。以上结果有助于更好的了解多房棘球绦虫RBP28的生物学特性与功能,也为探究多房棘球绦虫RBPs的作用机制积累了基础资料。

关键词：多房棘球蚴 rna结合蛋白28 免疫荧光免疫共沉淀质谱生物素标记

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