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TSWV rna检测示踪及DNA纳米材料递送miR159的抗病毒研究

TSWV RNA检测示踪及DNA纳米材料递送miR159的抗病毒研究

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作者：张万红中国农业科学院

学位级别：硕士

番茄斑萎病毒是经济作物上的重要病毒病,主要通过带毒介体蓟马传播,生产上尚无有效的防控途径,已成为世界上危害最严重的十大植物病毒之一。随着新兴学科和交叉学科的蓬勃发展,为植物病毒病精准防控提供了新的研究思路和突破路径。本研... 详细信息

番茄斑萎病毒是经济作物上的重要病毒病,主要通过带毒介体蓟马传播,生产上尚无有效的防控途径,已成为世界上危害最严重的十大植物病毒之一。随着新兴学科和交叉学科的蓬勃发展,为植物病毒病精准防控提供了新的研究思路和突破路径。本研究基于CRISPR/Cas13的rna编辑系统,通过对Cas13原核表达和cr rna体外转录,结合RPA技术,建立新的TSWV检测技术。基于CRISPR/Cas系统的示踪技术,结合生物素标记体系,初步开发TSWV rna在活细胞内复制轨迹可视化技术,实现了对病毒核酸在寄主细胞中的行为轨迹进行实时示踪,有望成为研究病毒侵染复制机制的有力手段之一。基于DNA自组装技术,以DNA为骨架构建了一种具有高编程性、高安全性和易修饰性的新型纳米材料,在本研究中通过四面体DNA纳米框架装载micro rna159,实现了mirna在植物叶片内的有效递送和抗病毒活性提升。1.基于CRISPR/Cas13a系统的TSWV检测体系的构建与应用。通过重组酶聚合酶等温扩增反应扩增CRISPR系统靶序列,利用原核表达及His标签提取纯化Cas13蛋白、体外转录合成cr rna构建基于CRISPR/Cas13a的TSWV检测体系。Cas13酶识别靶序列激发附带剪切活性,切割带有FAM荧光基团和BHQ1淬灭基团的ss rna探针,以短时间内检测体系产生的荧光信号强度变化区分阳性样品。阳性结果可以在20 min内通过显著增强的荧光信号区分。该检测系统的检测限度为2.26×102 copies/μL,比常规rna病毒检测方法RT-PCR的灵敏度提高10倍。此外,基于CRISPR/Cas13的检测系统对TSWV有较高选择性,不受其他病毒干扰。利用基于CRISPR/Cas13的检测体系对番茄叶片与蓟马样本进行检测,结果与RT-PCR检测结果完全一致。2.基于CRISPR/Cas13a的TSWV rna在植物细胞内的示踪检测。构建CRISPR/d Cas13a表达载体,设计靶向TSWV基因组rna的cr rna,同步构建生物素连接酶瞬时表达载体,通过与链霉亲和素修饰的纳米量子点混合浸润烟草叶片和原生质体细胞,利用激光共聚焦显微镜观察量子点与核衣壳蛋白的共定位信号,实现了TSWV rna在细胞当中的轨迹可视化检测,初步构建了TSWV rna的实时示踪体系。3.基于DNA自组装的miR159递送与表达。本实验基于小rna测序结果,选择miR159作为递送货物,制备miR159功能化的DNA四面体纳米药物,通过琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜、激光共聚焦显微镜、Zeta电位等方式进行表征,将DNA纳米材料浸润到本氏烟叶片中,利用转录组测序验证该纳米材料的浸润能够引起miR159对靶基因表达量的调控,q PCR检测纳米材料所携带的miR159显著上调。本研究首先融合CRISPR/Cas13和RPA反应,构建了TSWV在植株和介体中的检测技术,其次结合CRISPR/Cas13、生物素-亲和素反应和量子点标记技术,构建了TSWV的rna示踪技术,为TSWV的精准检测与复制机制研究奠定基础。DNA自组装与DNA杂交技术合成了miR159的递送系统(TDN-miR159),实现了miR159的高效输送和定向表达,拓展了植物抗病毒核酸药物的研发范畴。

关键词： CRISPR/Cas13a TSWV rna示踪病毒检测 DNA纳米材料

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Cas6FC示踪系统的优化设计

Cas6FC示踪系统的优化设计

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作者：陈寅河北科技大学

学位级别：硕士

活细胞rna示踪技术使研究人员能够可视化细胞或组织内的rna分子,为研究者提供了有关rna的时空定位、相互作用等重要信息。但目前的技术信噪比较低,不能准确定位rna在细胞中的位置。本文旨在设计一种适用范围广、信噪比高的rna示踪方法... 详细信息

活细胞rna示踪技术使研究人员能够可视化细胞或组织内的rna分子,为研究者提供了有关rna的时空定位、相互作用等重要信息。但目前的技术信噪比较低,不能准确定位rna在细胞中的位置。本文旨在设计一种适用范围广、信噪比高的rna示踪方法。本文基于本实验室开发的一种名为Cas6FC的rna示踪系统(d Ec Cas6FC),从Tri FC系统、荧光蛋白分裂位点优化、linker设计、新的Cas6蛋白筛选四个方面对d Ec Cas6FC示踪系统进行了优化设计,最终得到了一个新的rna示踪工具—d Nf Cas6FC示踪系统。将分裂的荧光蛋白片段(split-FP)偶联到失活的Nocardia farcinica Cas6蛋白(d Nf Cas6)的两端,通过Cas6蛋白的变构作用会使两端的荧光蛋白片段重组装成一个完整的荧光蛋白,进而发出荧光达到标记目的。相较于d Ec Cas6FC示踪系统,优化得到的d Nf Cas6FC示踪系统能在低温(27℃)下能稳定发挥示踪rna的功能,并且具有较高的信噪比。综上,本文开发的d Nf Cas6示踪系统在示踪rna方面有更稳定的效果,未来可以使用该系统示踪不同的细胞rna或者不同物种的rna,拓宽其在rna示踪领域的应用范围。

关键词： Cas6FC rna示踪 split-FP linker Cas6

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