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中华心血管病杂志 2023年第11期51卷 1166-1174页

作者：张淑晨赵小亚陈丽莉周祥苏州大学附属第二医院心血管内科苏州215004 苏州大学附属第二医院实验中心苏州215004

目的发现心肌梗死(MI)小鼠心肌组织中N6-腺苷酸甲基化(m6A)差异修饰的基因并探讨其在MI中可能参与的病理过程。方法取8~10周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠18只,按照随机数字表法将其分为MI组(n=9)和对照组(n=9)。应用rna甲基化测序(MeRIP-s... 详细信息

目的发现心肌梗死(MI)小鼠心肌组织中N6-腺苷酸甲基化(m6A)差异修饰的基因并探讨其在MI中可能参与的病理过程。方法取8~10周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠18只,按照随机数字表法将其分为MI组(n=9)和对照组(n=9)。应用rna甲基化测序(MeRIP-seq)检测2组小鼠心肌组织的m6A修饰基因,通过生物信息学分析如主成分分析和GO富集分析探索MI小鼠心肌组织rna甲基化修饰的特征并进行表达量、m6A修饰水平的验证及其功能预测。结果聚类热图分析显示相比于对照组,MI组m6A修饰水平上调和下调的基因分别有537个和364个。主成分分析显示对照组和MI组的m6A修饰差异可显著区分。m6A修饰的特征性序列为GGACU且主要集中在蛋白质编码区。rna-seq和MeRIP-seq联合分析显示发生差异m6A修饰同时伴随mrna差异表达的基因有119个。韦恩图显示不同基因m6A修饰差异和mrna表达差异。GO富集分析显示MI组中发生m6A差异修饰的基因主要参与心脏发育等过程。qPCR验证得知Gbp6水平上升、Dnaja1和Dnajb1水平下降,MeRIP-qPCR验证可知Hspa1b的m6A修饰水平下调。结论MI小鼠心肌组织中存在m6A差异修饰,发生m6A差异修饰的基因可能受甲基化相关酶的影响,进而通过调控凋亡和炎症影响心肌梗死的发生发展。

关键词：心肌梗死 rna甲基化修饰 rna甲基化测序

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Lncrna及m6A修饰调控奶牛乳腺上皮细胞损伤的分子机制

LncRNA及m6A修饰调控奶牛乳腺上皮细胞损伤的分子机制

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作者：林昌杰华中农业大学

学位级别：硕士

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）和大肠杆菌（Escherichia coli,***）是导致奶牛临床型和亚临床型乳房炎的两种常见病原微生物。在最近的研究中,长链非编码rna（Long non-coding rna,Lncrna）被发现在微生物诱导剂引发的... 详细信息

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus,***）和大肠杆菌（Escherichia coli,***）是导致奶牛临床型和亚临床型乳房炎的两种常见病原微生物。在最近的研究中,长链非编码rna（Long non-coding rna,Lncrna）被发现在微生物诱导剂引发的免疫应答中发挥重要作用。然而Lncrna在牛乳腺炎中的作用尚不清楚。本研究旨在探讨***和***对牛乳腺上皮细胞损伤的影响,解析Lncrna在细胞损伤中的作用,并预测细胞损伤中可能的分子调控机制。另外,本研究根据Lncrna-seq以及Lncrna的MeRIP-seq的测序数据,进行基因的筛选。通过RT-qPCR实验对筛选基因进行验证,验证发现LOC104974191分子在***感染的MAC-T细胞中发生了表达量的上调以及m6A修饰水平的下调。推测去甲基化酶ALKBH5是调控LOC104974191发生差异甲基化修饰的关键酶。本研究使用RT-qPCR、FISH、MeRIP-qPCR、sirna干扰技术、过表达载体的构建及Western Blot,流式细胞术等实验方法进行验证。具体研究结果如下:1.奶牛乳腺上皮细胞体外炎症模型的建立高温灭活***与***以MOI=10:1的用量刺激牛乳腺上皮细胞,刺激24 h后,使用RT-qPCR检测发现两种灭活菌均能促进IL-1β、IL-6和TNF-α的表达量显著上升（p＜0.05）,表明乳腺炎体外模型的成功构建。使用CCK8检测细胞的生长活性,利用流式细胞术检测细胞ROS水平、细胞周期以及细胞凋亡率,发现灭活的金黄色葡萄球菌以及大肠杆菌刺激细胞24 h后,能促进ROS过表达,细胞周期停滞,以及细胞凋亡率显著提高。2.奶牛乳腺上皮细胞中Lncrna-seq表达谱绘制及分析对乳腺上皮细胞体外炎症模型的Lncrna-seq进行数据分析。本研究在大肠杆菌刺激组中发现了 2342个差异表达的Lncrna,在金黄色葡萄球菌刺激组中发现了2313个差异表达的Lncrna。并发现在两个不同刺激组中,存在2225个相同的Lncrna有差异表达。其中大肠杆菌有268个显著性差异的Lncrna,金黄色葡萄球菌刺激组中有238个显著性差异的Lncrna,并对其进行物信息学分析,发现大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的邻近编码基因靶向的信号通路具有相似的功能,且显著性差异的Lncrna主要富集于PI3K-Akt信号通路,ErbB信号通路以及细胞紧密连接信号通路,并成功构建两个Lncrna-mirna-mrna相互作用网络。3.奶牛乳腺上皮细胞中整体甲基化修饰检测检测乳腺上皮细胞体外炎症模型中整体mrna的m6A甲基化水平,发现在两种灭活菌刺激细胞24 h后,能够使得细胞整体的m6A修饰水平发生显著性的提高（p＜0.05）;同时使用RT-qPCR分别检验了 m6A修饰酶在两个刺激组中的mrna相对表达量变化,发现甲基化酶METTL3、METTL14、WTAP的mrna表达水平呈现显著性升高（p＜0.05）,与整体甲基化水平升高的趋势相符,而在去甲基化酶中,检测到了 ALKBH5的mrna表达水平两种灭活菌刺激组中升高（p＜0.05）,但是FTO的表达水平在两种灭活菌刺激组未见明显差异（p＞0.05）。4.奶牛乳腺上皮细胞Lncrna MeRIP-seq修饰谱的绘制及分析对乳腺上皮细胞体外炎症模型的Lncrna的MeRIP-seq进行数据分析,发现***刺激组有112个Lncrna中存在298个差异的m6A峰;***刺激组有288个Lncrna中存在920个差异的m6A峰,并且在***组和***组中检测到105个相同的Lncrna的m6A峰均发生高甲基化修饰,有90个相同的Lncrna的m6A峰发生低甲基化修饰。对差异的m6A修饰的Lncrna进行功能预测,发现其主要富集于NF-κB信号通路、Wnt信号通路、mTOR信号通路等。对Lncrna-seq已经Lncrna的MeRIP-seq进行联合分析发现,在***组中有139个差异表达的Lncrna、***中有20个差异表达的Lncrna,同时也发生了 m6A甲基化差异修饰,推测这些Lncrna的表达水平变化可能受到了 m6A甲基化的调控。5.长链非编码rnaLOC104974191的筛选与鉴定根据Lncrna-seq以及Lncrna的MeRIP-seq的测序数据,对刺激组中发生差异甲基化修饰的Lncrna进行筛选,发现LOC104974191上的m6A修饰水平在***刺激组发生显著降低。并通过使用IGV软件对其进行了甲基化峰的可视化,使用MeRIP-qPCR检测到LOC104974191分子

关键词：奶牛乳腺上皮细胞金黄色葡萄球菌大肠杆菌 Lncrna测序 rna甲基化测序去甲基化酶ALKBH5 细胞损伤凋亡

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