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天津医科大学学报 2024年第4期30卷 289-294页

作者：付豪冯玉梅天津医科大学肿瘤医院肿瘤研究所生物化学与分子生物学研究室乳腺癌防治教育部重点实验室天津市恶性肿瘤临床医学研究中心国家恶性肿瘤临床医学研究中心天津300060

目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角... 详细信息

目的:构建可在体外稳定培养和传代的肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并鉴定其生物学特征。方法:取人乳腺浸润性导管癌组织,采用酶解-组织块培养法和差速贴壁法分离纯化CAFs,用免疫荧光检测α-肌动蛋白、血小板源性生长因子受体β和广谱细胞角蛋白;采用人端粒酶表达慢病毒感染CAFs使其永生化;在商品化FGM-2(fibroblast growth medium-2)培养基的基础上添加谷氨酰胺、非必需氨基酸和抗坏血酸以优化培养条件,在体外连续培养传代,并用β-半乳糖苷酶染色鉴定各代细胞中衰老细胞的比例。对构建成功的CAF1、CAF2和CAF3细胞系进行高通量rna测序,分析差异表达基因(DEGs)及其相关信号通路;基于3个CAF细胞系CAF亚型标志基因的表达水平,鉴定其生物学特征。结果:成功分离原代CAFs,并构建3株永生化CAF细胞系;成功优化了CAFs的培养条件,使CAF细胞系在体外培养时不易发生细胞衰老表型(t=2.972、7.049,均Prna测序结果分析显示,CAF1与CAF2有3150个DEGs,CAF2与CAF3有3544个DEGs;而CAF1与CAF3有343个DEGs。对DEGs进行GO富集分析(gene ontology enrichment analysis)表明,CAF2高表达基因主要参与蛋白水解、细胞外基质重塑、血管生成和细胞黏附等信号通路;CAF1和CAF3高表达基因主要参与细胞分裂、细胞周期、DNA损伤修复和有丝分裂等信号通路。对3个CAF细胞系亚型特征性分析表明,CAF1和CAF 3具有炎性CAFs特征,CAF2具有基质型CAFs特征。结论:成功构建得到3株可在体外稳定传代且具有不同生物学特征的CAF细胞系,为CAFs在乳腺癌发生和进展中作用机制的研究提供了可靠的细胞模型。

关键词：乳腺癌肿瘤相关成纤维细胞永生化 rna测序分析 CAF亚型

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USP53通过抑制NF-κB通路调控肾透明细胞癌的发生和发展

USP53通过抑制NF-κB通路调控肾透明细胞癌的发生和发展

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作者：董铸峰武汉大学

学位级别：硕士

背景:肾细胞癌（RCC）是一种起源于肾脏实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,占成人恶性肿瘤的3%左右。在RCC中肾透明细胞癌（cc RCC）占据80%,每年有超过14万人死于cc RCC,且近30%的cc RCC患者在进行局部肿瘤切除手术后仍然会复发和转移。... 详细信息

背景:肾细胞癌（RCC）是一种起源于肾脏实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,占成人恶性肿瘤的3%左右。在RCC中肾透明细胞癌（cc RCC）占据80%,每年有超过14万人死于cc RCC,且近30%的cc RCC患者在进行局部肿瘤切除手术后仍然会复发和转移。RCC难以诊断和治愈的根本原因是其发病机理和分子机制尚不清楚,所以研究RCC的分子机制并寻找安全有效的生物学靶点尤其重要。研究表明在RCC病人中E3泛素连接酶VHL双等位基因失活占据50%-80%,提示泛素化和去泛素化调控在RCC中至关重要。泛素特异性肽酶53（USP53）属于去泛素化酶家族,有报道证明USP53与小儿胆汁淤积性肝病、肥胖、坎图综合征等疾病有关,但其在肿瘤中的作用仍需要进一步研究。方法:我们通过生物信息学手段在GEO和TCGA数据库中对cc RCC进行差异性基因分析,并发现USP53与cc RCC的发生和发展具有相关性。我们又通过慢病毒感染的方式构建了USP53过表达和敲低的Caki-1和786-O的稳转细胞系,并通过CCK-8、EDU、Brd U细胞增殖实验和划痕、Transwell细胞转移实验深入探究其潜在的生物学功能。然后我们通过rna测序分析以及蛋白质免疫印迹实验（Western-blot）进一步探究USP53影响cc RCC发生和发展的分子机制。最后,我们通过裸鼠皮下成瘤实验验证在体内环境下USP53对cc RCC的影响。结果:对cc RCC进行差异基因分析,结果显示,与正常组织相比cc RCC组织中的USP53的基因表达量更低,并且和临床预后显著负相关,在cc RCC的恶性分级中,USP53的表达随着cc RCC的恶性程度的增高而降低。细胞增殖和转移实验结果表明USP53的过表达引起cc RCC细胞增殖和转移的显著抑制;USP53敲低后cc RCC细胞的增殖和转移能力又显著增强。rna测序分析结果表明,USP53过表达后引起NF-κB信号通路中大量炎症基因表达降低,通过Western-blot进行的验证结果表明,USP53过表达后IKKβ和P65的磷酸化水平降低,IκBα的表达增加导致NF-κB通路的活性受到抑制;而当USP53敲低后,IKKβ和P65的磷酸化水平升高,IκBα的表达降低,该通路活性增强。裸鼠皮下成瘤实验结果表明,敲除USP53后可以明显促进cc RCC生长。结论:USP53很可能是通过NF-κB通路来调控来调节cc RCC的发生和发展,我们的研究揭示了USP53可能作为NF-κB通路的调控因子,在cc RCC的发展过程中起关键作用。另外,靶向USP53可能是治疗cc RCC的一种新策略。

关键词：肾透明细胞癌泛素特异性肽酶53 生物信息学分析裸鼠荷瘤实验 rna测序分析

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