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一种新乙型肝炎病毒表型耐药分析方法的建立

中华传染病杂志 2014年第5期32卷 257-262页

作者：李新艳陈良马张妹毛日成黄玉仙张继明上海市公共卫生临床中心肝病科 201508 复旦大学上海医学院教育部、卫生部医学分子病毒学重点实验室复旦大学附属华山医院感染科

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV dna,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）... 详细信息

目的建立一种新的、简便的HBV表型耐药分析方法,通过置换完整的反转录酶（RT）区研究药物敏感性.方法首先全基因扩增未经核苷（酸）类似物治疗患者的HBV dna,构建含HBV野毒株全基因组表达质粒PHY536207（B基因型）及PHY97（C基因型）,继而在RT区上、下游设计限制酶切位点,改造后的质粒分别命名为mPHY536207及mPHY97.以CHB患者血清中分离到的拉米夫定（LAM）耐药变异株和阿德福韦酯（ADV）耐药变异株为骨架,分别构建LAM耐药株质粒PHY634和ADV耐药株质粒PHY6923,再用耐药株的RT区段取代mPHY536207中的RT区构建重组质粒,命名为RT634（LAM耐药）及RT6923（ADV耐药）.分别用RT区置换前、后的质粒转染Huh7细胞,用ELISA法检测分泌到细胞上清液中的HBsAg水平,用实时PCR和Southern印迹法检测细胞内HBVdna水平.结果成功构建B型和C型野毒株表达质粒PHY536207和PHY97,经转染Huh7细胞证实有HBV复制能力,6孔细胞培养板中每孔细胞所抽提的HBV dna均＞1＆#215;107拷贝/mL;在RT区上游设计的Pst Ⅰ酶切位点不影响HBV的表型（HBsAg的表达及HBV dna的复制）.在PHY634及RT634转染实验中,HBV dna水平却并未随LAM浓度的升高而明显下降,50％抑制浓度（IC50）＞100 μmol/L,mPHY536207仅为0.18 μmol/L;PHY6923及RT6923转染实验中,HBV dna对外加的ADV不敏感,IC50＞100 μmol/L,明显高于mPHY536207（1.2 μmol/L）.结论本研究建立了一种新的HBV表型耐药分析方法,可通过RT区置换来研究RT区变异对药物敏感性的影响.

关键词：肝炎病毒,乙型 rna指导的dna聚合酶抗药性表型

构建人端粒酶反转录酶修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株

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中国组织工程研究 2015年第23期19卷 3621-3627页

作者：刘慧萍钟晓龙赵晴黄文起安珂中山大学附属第一医院麻醉科广东省广州市510080

背景:骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。目的:构建永生化大鼠骨髓间... 详细信息

背景:骨髓间充质干细胞具有取材方便、多向分化及低免疫原性等优点,是转基因细胞移植镇痛领域中的理想载体细胞,但由于骨髓中间充质干细胞含量有限、体外培养的复制性衰老等问题,制约其在镇痛研究中的应用。目的:构建永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植镇痛提供载体细胞来源。方法:构建携带人端粒酶反转录酶基因的慢病毒pL V-Puro-EF1α-h TERT并转染第3代骨髓间充质干细胞后进行嘌呤霉素筛选,获得阳性细胞克隆并扩大培养,分别采用RT-PCR和TRAP法检测转染细胞人端粒酶反转录酶的表达和端粒酶活性,同时观察细胞形态、增殖和诱导分化能力、表面分子以及Nestin、MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达,检测细胞染色体核型和致瘤性。结果与结论:人端粒酶反转录酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以体外连续培养超过30代。与未转染的细胞和对照病毒转染的细胞相比,慢病毒转染的骨髓间充质干细胞人端粒酶反转录酶mR NA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高,细胞周期主要处于G2/M以及S期,增殖指数明显升高;细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%,而CD34、CD45表达阳性率不足5%,胞浆Nestin的表达阳性,而MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达,保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力,细胞形态、染色体核型均正常,裸鼠接种无致瘤性。以上结果提示成功构建了人端粒酶反转录酶基因修饰的永生化大鼠骨髓间充质干细胞株,为转基因细胞移植用于镇痛研究提供了生物学性状均一、稳定的安全载体细胞。

关键词：骨髓间质干细胞端粒,末端转移酶 rna指导的dna聚合酶干细胞骨髓干细胞人端粒酶反转录酶骨髓间充质干细胞永生化镇痛国家自然科学基金

纳米羟基磷灰石介导靶向hTERT的rna干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖

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中华胸心血管外科杂志 2010年第1期26卷 41-44页

作者：郑庆丰王建军应敏刚柳硕岩福建省肿瘤医院胸外科福州350014 华中科技大学同济医学院附属协和医院胸外科

目的探讨纳米羟基磷灰石（nHAP）介导靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的rna干扰对人肺癌A549细胞的影响。方法采用均相沉淀法制备nHAP。分为nHAP—PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组，分别配制转染复合物并转染人肺癌A549细胞。MTT法测定细... 详细信息

目的探讨纳米羟基磷灰石（nHAP）介导靶向端粒酶逆转录酶（hTERT）的rna干扰对人肺癌A549细胞的影响。方法采用均相沉淀法制备nHAP。分为nHAP—PLL组、脂质体组、nHAP组及对照组，分别配制转染复合物并转染人肺癌A549细胞。MTT法测定细胞生长活力；Western Blot检测hTERT蛋白表达，流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果nHAP-PLL组、脂质体组与nHAP组的A549细胞增殖受到抑制，较对照组差异有统计学意义（P〈0．05）；nHAP—PLL组抑制细胞增殖较脂质体组及nHAP组明显，差异均有统计学意义（P〈0．05）。各组的hTERT蛋白表达的变化趋势与人肺癌A549细胞的增殖情况一致。流式细胞仪检测nHAP—PLL组、脂质体组及nHAP组均有不同程度的细胞凋亡，凋亡率与对照组差异有统计学意义，P〈0．05。结论nHAP本身能诱导人肺癌A549细胞凋亡，经PLL修饰后能有效地结合保护dna并介导人肺癌A549细胞的基因转染，介导靶向hTERT的rna干扰可有效抑制人肺癌A549细胞增殖。

关键词：羟基磷灰石类端粒 rna指导的dna聚合酶肺肿瘤 A549细胞纳米颗粒

miR-138靶基因hTERT的生物信息学预测及鉴定

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实用肿瘤杂志 2013年第6期28卷 579-582页

作者：陈陵陈先华梁光萍范亚川王国威宋航邹利全中国人民解放军第三二四医院消化内科重庆400020 中国人民解放军第三军医大学西南医院烧伤研究所重庆400038

目的预测并鉴定miR-138的靶基因人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。方法采用生物信息学技术,预测miR-138与hTERT 3'UTR结合位点及结合后稳定性。分别采用RTqPCR、Western blot技术检测过表达miR-138后MKN-45细胞内hTERT在mrna与蛋白水平的变化。采用双荧光素酶实验及突变实验,验证miR-138与hTERT mrna的结合位点。结果生物信息学技术预测显示,miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR。miR-138过表达后可明显抑制MKN-45细胞内hTERT蛋白表达水平(Prna水平无显著影响(P>0.05)。双荧光素酶实验证实miR-138可稳定结合于hTERT 3'UTR相应位点。结论 miR-138通过直接结合于靶基因hTERT 3'UTR抑制hTERT蛋白表达。miR-138可能成为基于mirna的肿瘤基因治疗的新靶标。

关键词：胃肿瘤微rnas 端粒 rna指导的dna聚合酶萤光素酶类逆转录聚合酶链反应基因表达

负载miR-138复制缺陷型腺病毒对hTERT表达的影响

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重庆医学 2011年第29期40卷 2947-2948,2951页

作者：刘志鹏王宗华梁光萍熊晓峰范亚川邹利全王洪斌陈陵李学成中国人民解放军第三二四医院消化内科重庆400020 第三军医大学护理学院重庆400038 第三军医大学西南医院烧伤研究所重庆400038

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采... 详细信息

目的探讨以复制缺陷型腺病毒为载体,上调人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138表达丰度后,能否有效抑制靶基因hTERT的表达。方法将负载hTERT调控相关miR-138的复制缺陷型腺病毒以200∶1的感染复数(MOI),感染人胃癌BGC-823细胞;采用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测BGC-823细胞内miR-138和hTERT mrna的表达丰度;Western Blot检测hTERT蛋白表达。结果与阴性对照腺病毒相比,负载miR-138的腺病毒感染BGC-823细胞后,可显著提高miR-138表达丰度(P0.05)。与感染阴性对照腺病毒的BGC-823细胞相比,感染负载人miR-138腺病毒(Ad-miR138)的BGC-823细胞内hTERT蛋白表达有所下调。结论以复制缺陷型腺病毒为载体,可有效上调hTERT调控相关miR-138的表达丰度,进而可有效抑制miR-138靶基因hTERT的表达水平。

关键词： rna指导的dna聚合酶胃肿瘤复制缺陷型腺病毒载体

端粒酶逆转录酶高表达新生鼠真皮细胞株的构建及其生物学功能的初步研究

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实用医学杂志 2011年第12期27卷 2136-2138页

作者：谭挺胡志奇南方医科大学南方医院整形外科广州市510515

目的:以逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT为介导构建TERT高表达新生鼠真皮细胞株,并观察其相关生物学功能变化情况。方法:将pLEGFP-N1-TERT感染C57新生鼠真皮细胞,并用G418筛选法进行阳性克隆的筛选并培养观察,同时将空载对照。两组细胞均... 详细信息

目的:以逆转录病毒载体pLEGFP-N1-TERT为介导构建TERT高表达新生鼠真皮细胞株,并观察其相关生物学功能变化情况。方法:将pLEGFP-N1-TERT感染C57新生鼠真皮细胞,并用G418筛选法进行阳性克隆的筛选并培养观察,同时将空载对照。两组细胞均经MTT法检测生长情况,流式检测表面标记物CD44、CD133的表达情况,Westernblot法检测TERT蛋白的表达,免疫组化检测Versican表达。结果:荧光显微镜下观察TERT高表达细胞发出绿色荧光,其生长速度较对照趋缓,其CD44、CD133、TERT蛋白、Versican表达均升高。结论:本实验获得TERT高表达新生鼠真皮细胞株,其毛发诱导能力较高,可作为毛囊细胞移植种子细胞来源之一。

关键词： rna指导的dna聚合酶逆转录病毒载体真皮细胞毛囊细胞移植

负载hTERT调控相关miR-138复制缺陷型腺病毒的包装及鉴定

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重庆医学 2011年第9期40卷 896-898页

作者：熊晓峰陈陵范亚川邹利全张方征王洪斌游斌刘志鹏解放军第三二四医院消化内科重庆400020

目的包装负载人端粒酶逆转录酶(hTERT)调控相关miR-138前体全长cdna(pre-miR-138)的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-miR138)。方法 pre-miR-138全基因合成后插入腺病毒穿梭质粒(pDC315-miR138),与腺病毒包装质粒pBHGloxDel-taE1、3Cre共转染人胚肾293细胞(HEK293),包装Ad-miR138并大量扩增,收集纯化。对纯化后的Ad-miR138进行滴度测定、感染性鉴定、电镜鉴定及双引物PCR鉴定。结果包装成功的腺病毒载体具有良好的感染性,纯化浓缩后的病毒滴度可达5×1010pfu/mL。电镜可见病毒在HEK293细胞中大量复制。PCR双引物鉴定Ad-miR138可扩增出Ad及pre-miR-138特异片段,而对照Ad-LacZ只能扩增出Ad特异片段,不能扩增出pre-miR-138特异片段。结论成功包装了负载miR-138全长cdna的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究微rnas(micrornas)在肿瘤发生、发展中的作用,以及hTERT调控相关miR-138在肿瘤治疗中的价值奠定了基础。

关键词： rna指导的dna聚合酶微rnas 人胚肾293细胞复制缺陷型腺病毒载体

sirna靶向沉默hTERT基因对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡和周期的影响

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中华临床医师杂志（电子版） 2008年第10期2卷 36-42页

作者：钟英强魏菁罗招凡傅玉如邵静刘娟朱兆华中山大学附属第二医院消化内科广州510120 中山大学医学研究中心广州510120 中山大学生物分子检验中心广州510120

目的研究hTERT-sirna对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法利用rnai技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果在hTERT-sirna的使... 详细信息

目的研究hTERT-sirna对人胰腺癌Capan-2细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响。方法利用rnai技术靶向沉默Capan-2的hTERT基因表达,应用细胞直接计数法和流式细胞术(FCM)检测Capan-2细胞的增殖、凋亡和细胞周期的变化。结果在hTERT-sirna的使用浓度为50nm、Lipo转染浓度为3μl/2ml转染体积和hTERT沉默效率为100%的条件下,转染hTERT-sirna24h后,细胞生长已明显减慢,抑制细胞增殖率为26.39%(Prna组与阴性对照组和Lipo对照组均有明显差异(Prna可抑制人胰腺癌Capan-2细胞生长,使较多的细胞停留在G0～G1期,而进入G～M期和S期的细胞减少,可促进细胞凋亡。

关键词：胰腺肿瘤 Capan-2细胞株 rna指导的dna聚合酶 rna,小分子干扰细胞增殖细胞凋亡细胞周期

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

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中国医药生物技术 2010年第6期5卷 438-441页

作者：孔艳吴小红杨立宏安祺董关木俞永新中国药品生物制品检定所北京100050

目的在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2rna为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9U/μl)标准品催化体外... 详细信息

目的在传统产物增强性反转录酶(PERT)活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量PCR方法。方法以噬菌体MS2rna为模板,设计、合成引物和探针,并分别以连续10倍倍比稀释的AMV反转录酶(1×10-1～1×10-9U/μl)标准品催化体外反转录反应合成相应cdna。采用实时荧光定量PCR法检测底物cdna模板量,并获得相应的PCR荧光值曲线,分析AMV反转录酶的相对活性。同时应用传统PERT方法对cdna进行扩增,测定该方法的灵敏度。结果将AMV反转录酶标准品连续10倍倍比稀释后催化反转录反应,实时荧光定量PCR分析所得的反转录产物cdna,结果得到与理论值完全相符合的PCR标准荧光值曲线;定量分析结果显示,浓度为1×10-2～1×10-8U/μl的AMV反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV反转录酶,经传统PERT方法扩增后,结果显示浓度为1×10-3～1×10-7U/μl的AMV反转录酶均可见大小为112bp的阳性条带,检测灵敏度达到1×10-7U/μl。结论成功建立了基于实时荧光定量PCR技术的检测反转录酶活性的新方法,实验操作简单,具有高精确性和无污染性,为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。

关键词：聚合酶链反应 rna指导的dna聚合酶