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中华实验眼科杂志 2016年第1期34卷 11-16页

作者：田芳东莉洁吉洁周玉李文博白伶伶王飞漆晨苏畅张晓敏李筱荣天津医科大学眼科医院天津医科大学眼科研究所天津医科大学眼视光学院 300384

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制... 详细信息

背景视网膜新生血管（RNV）是多种眼底血管疾病的共同表现，研究证实胰岛素样生长因子（IGF-1）能够刺激血管内皮细胞的增生，从而促进新生血管的形成，而多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制的作用。但PSF在RNV形成过程中的作用尚不清楚。目的研究PSF对IGF-1／血管内皮生长因子（VEGF）信号通路的调控作用。方法将猕猴视网膜血管内皮细胞RF／6A进行培养后分为Pegfp-C2-PSF质粒转染组、pGenesil．PSF-rnai质粒转染组及各自的对照组，分别在细胞中转人真核质粒Pegfp—C2-PSF、pGenesil—PSF—rnai及相应的空白质粒。各组细胞培养液中分别添加或不添加胰岛素样生长因子1（IGF-1）以刺激细胞生长，采用MTT法检测各组RF／6A细胞的增生率并筛选各组最适PSF剂量，用于进一步的实验。采用逆转录PCR法测定和比较不同PSF转染组间用或不用U0126处理组间RF／6A细胞中VEGFmrna的表达；采用Westernblot法验证PSF对IGF-1诱导的细胞外调节蛋白激酶（ERK）活化的促进作用。结果IGF-1刺激后Pegfp．C2．PSF质粒转染组以0．50IxgPSF为最适剂量，其RF／6A细胞的增生率为0．220±0．020，细胞中VEGFmrna相对表达量为0．79±0．07，分别低于其对照组的0．260±0．006和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．040、0．016）；IGF-1刺激后pGenesil—PSF—rnai质粒转染组以1．00IxgPSF作为最适剂量，其RF／6A细胞增生率为0．35±0．02，VEGFmrna相对表达量为2．29＋0．43，分别高于其对照组的0．210-4-0．019和未转染组的1．26±0．19，差异均有统计学意义（P=0．003、0．019）。IGF-1刺激后1、3、6hPegfp-C2-PSF质粒转染组细胞中pERK蛋白表达量均明显低于未转染组，差异均有统计学意义（P=0．017、0．000、0．000）。Pegfp-C2-PSF质粒转染组U0126’处理后细胞中VEGFmrna的相对表达量为0．93±0．21，明显低于未转染组的1．32±0．08，差异均有统计学意义（P=0．037），同时明显低于Pegfp—C2-PSF质粒转染组无U0126处理的细胞中VEGFmrna的相对表达量1．23±0．09，差异有统计学意义（P=0．002）。结论PSF可抑制IGF-1诱导的RF／6A细胞中的ERK信号通路的活化，下调VEGF在RF／6A细胞中的表达，进而抑制RF／6A细胞的增生。

关键词：多聚嘧啶序列结合蛋白 rna剪切胰岛素样生长因子细胞系内皮细胞/药物作用视网膜血管/细胞学血管内皮生长因子细胞外调节蛋白激酶

CCACA碱基序列是玉米CMS-S线粒体orf355-orf77转录本剪切识别位点

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中国生物化学与分子生物学报 2013年第6期29卷 555-562页

作者：秦雅婷赵衍鑫岳兵肖海林华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室武汉430070

玉米S型细胞质雄性不育系(CMS-S)及其近等基因恢复系是研究核-质互作机制的重要遗传资源和理想模式体系.目前认为,CMS-S花粉败育是由其线粒体内细胞质不育基因orf355-orf77表达的毒性蛋白引起,而核育性恢复基因Rf3可通过引发orf355-orf7... 详细信息

玉米S型细胞质雄性不育系(CMS-S)及其近等基因恢复系是研究核-质互作机制的重要遗传资源和理想模式体系.目前认为,CMS-S花粉败育是由其线粒体内细胞质不育基因orf355-orf77表达的毒性蛋白引起,而核育性恢复基因Rf3可通过引发orf355-orf77转录本的降解而解除其毒性作用,使花粉育性得以恢复.本研究采用Northern杂交和3'RACE技术确定了orf355-orf77转录本的剪切位点,并发现在育性恢复的花粉中,orf355-orf77转录本被剪切成小片段之后聚合了poly(A)序列,推测这一过程加速了mrna分子的降解,是育性恢复的关键环节.利用生物信息学方法分析了orf355-orf77转录本6个剪切位点的侧翼序列,发现在剪切位点下游10个碱基的位置均含有5'-CCACA-3'序列,推测该序列受到特定功能蛋白的识别,然后募集核酸内切酶对其进行剪切.研究结果可为揭示玉米CMS-S育性恢复机理提供重要的理论依据.

关键词： S型细胞质雄性不育 rna剪切育性恢复多聚腺苷酸化玉米

SlPPR1调控番茄耐冷性和叶绿体发育的作用研究

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SlPPR1调控番茄耐冷性和叶绿体发育的作用研究

作者：吴昆林沈阳农业大学

学位级别：硕士

番茄(Solanum lycopersicum)是世界生产面积最大的蔬菜作物,中国是番茄生产第一大国。在我国设施番茄生产中,低温胁迫成为影响番茄产量的主要的非生物因素,中国北方寒区冬半年设施番茄生产因低温导致的产量损失达10%～50%,已成为影响设... 详细信息

番茄(Solanum lycopersicum)是世界生产面积最大的蔬菜作物,中国是番茄生产第一大国。在我国设施番茄生产中,低温胁迫成为影响番茄产量的主要的非生物因素,中国北方寒区冬半年设施番茄生产因低温导致的产量损失达10%～50%,已成为影响设施番茄生产的重要因子,严重影响了经济效益。rna结合蛋白(rna Binding Protein,RBP)作为转录后水平的调控蛋白,参与了植物生长发育、生理代谢和逆境胁迫响应。目前,RBP参与植物低温胁迫响应的研究主要集中在水稻和拟南芥上,而在番茄中的研究较少。本研究试图探究RBP参与番茄低温胁迫的分子机制,为生产上的栽培措施以及抗冷番茄品种的培育研究提供理论依据。主要研究结果如下:1.低温诱导下的番茄转录组检测数据结果显示,RBP家族PPR类中5个基因上调表达,分别命名为SlPPR1、SlPPR2、SlPPR3、SlPPR4和SlPPR5。2.将上述5个基因沉默后进行低温处理,测定相关生理指标,发现只有沉默TRV-SlPPR1的植株表现出低温耐受性弱,表明SlPPR1参与了番茄幼苗的低温胁迫响应。3.通过测定SlPPR1在番茄幼苗根、茎、子叶、幼叶和成熟叶片中的表达状况,并结合亚细胞定位结果,确定SlPPR1定位于番茄叶片的叶绿体中,在叶绿体内行使功能。4.内含子剪切分析结果表明,SlPPR1参与ndh B的内含子剪切,并导致SlPPR1沉默植株出现失绿表型。5.通过外源喷施ABA、SA和MeJA三种物质,发现只有ABA可以诱导SlPPR1的上调表达。6.通过测定叶绿体基因表达量,发现沉默TRV-SlPPR1植株的光合系统Ⅰ(psa)和Ⅱ(psb)基因、NADH质体醌氧化还原酶亚基(ndh)基因和细胞色素b6/f复合体(pet)相关基因表达量下调。透射电镜结果显示,沉默植株叶绿体的发育受到了影响。以上结果表明,SlPPR1通过调控番茄叶绿体基因的内含子的剪切和表达,从而影响叶绿体的功能和发育,进而参与番茄幼苗的低温胁迫响应,同时可能参与ABA信号通路。

关键词：番茄低温胁迫 rna结合蛋白三角状五肽重复蛋白 rna剪切

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催化rna切割反应的新型短结合臂脱氧核酶

催化RNA切割反应的新型短结合臂脱氧核酶

作者：王月瑶南京大学

学位级别：硕士

核酸是生命必需的生物大分子,在生命体中除了行使存储和传递遗传信息的功能之外,在遗传信息的表达过程中也起到了重要的调控作用。20世纪80年代以前,生物酶的概念普遍与蛋白质联系在一起。自从Sidney Altman和Thomas Robert Cech实验室... 详细信息

核酸是生命必需的生物大分子,在生命体中除了行使存储和传递遗传信息的功能之外,在遗传信息的表达过程中也起到了重要的调控作用。20世纪80年代以前,生物酶的概念普遍与蛋白质联系在一起。自从Sidney Altman和Thomas Robert Cech实验室发现细胞内存在具有催化功能的rna之后,生物酶的范围由蛋白质扩展至包括核酸。除了天然的生物酶之外,科学家可在实验室利用分子进化的手段产生人工蛋白酶和核酸酶,这些人工酶在生物医药领域发挥了重要的作用。脱氧核酶是一类具有催化活性的单链DNA分子,其通过折叠形成特定的三维结构可以催化多种化学反应,例如rna切割、rna连接和DNA切割等。其中,切割rna的脱氧核酶通过Watson-Crick碱基互补配对与靶标rna序列靶向结合,催化rna在特定位置发生断裂,在生物传感器及基因治疗领域得到了重视和迅速的发展。在众多不同催化活性的核酸酶中,8-17是一种研究透彻、应用广泛的催化rna切割反应的脱氧核酶。然而,8-17具有一定的底物序列偏好性,难以催化某些rna底物发生位点特异性切割反应(例如UU连接处),因此通过体外筛选手段鉴定新的催化rna切割反应的脱氧核酶具有重要意义。在这里,我们报告了一种新的脱氧核酶,称为10-12opt,具有异常短的底物结合臂。该脱氧核酶含有14个碱基组成的催化核心,其优先催化底物在5'-UN-3,二核苷酸处的切割(对于UU切割,kobs=0.9h-1)。其左结合臂仅含有三个碱基并只与rna底物形成两个经典碱基配对。突变分析表明,切割位点下游+4位置的鸟嘌呤碱基参与催化,该碱基不与脱氧核酶形成经典的碱基配对,才能达到最佳的催化效果。进一步研究表明该碱基6号位的羰基可能直接参与脱氧核酶的催化反应。对10-12opt进行功能性表征发现其催化rna底物切割依赖于金属离子的浓度和pH,在pH为7.5,镁离子浓度为50mM时,切割速率为0.015min-1。通过对rna底物切割位点下游的碱基进行单位点突变分析,我们发现,脱氧核酶10-12opt特异性识别并切割含有UNGAG序列的rna底物。于是我们选择了三条含此共有序列、但切割位点不同的microrna作为底物进行了体外切割反应,结果发现10-12opt可以催化所有microrna底物发生位点特异性切割反应,而8-17仅能催化其中一条发生反应。此外,我们将10-12opt的rna底物与ATP的DNA适配体连接以构建ATP分子生物传感器。实验结果表明,传感器信号随ATP浓度升高而逐渐增强。综上所述,这些结果表明10-12opt是一种新型的、不同于8-17的、催化rna切割反应的脱氧核酶序列,其底物序列选择性与现有的脱氧核酶可有效互补,可催化某些rna分子在UU连接处发生位点特异性切割反应。

关键词：体外筛选脱氧核酶 rna剪切

拟南芥PPR蛋白PDM1调控rpoA基因转录后表达的研究

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拟南芥PPR蛋白PDM1调控rpoA基因转录后表达的研究

作者：尹倩倩上海师范大学

学位级别：硕士

拟南芥PDM1基因编码一个PPR家族PLS亚家族蛋白，为叶绿体rpoA多顺反子加工所必需。本研究发现PDM1在rpoA单顺反子的剪切和叶绿体发育上具有重要作用。拟南芥pdm1突变体呈白化致死表型，叶绿体发育存在严重缺陷。将PDM1与GFP构建的融合... 详细信息

拟南芥PDM1基因编码一个PPR家族PLS亚家族蛋白，为叶绿体rpoA多顺反子加工所必需。本研究发现PDM1在rpoA单顺反子的剪切和叶绿体发育上具有重要作用。拟南芥pdm1突变体呈白化致死表型，叶绿体发育存在严重缺陷。将PDM1与GFP构建的融合载体在拟南芥原生质体中表达，GFP荧光与叶绿素荧光共定位，这说明PDM1定位于叶绿体。在pdm1突变体中，大约990nt的rpoA单顺反子转录本缺失。我们检测了PEP和NEP共同转录的atpB基因在pdm1中的转录模式，发现PEP转录的2.6kb条带检测不到，仅存在NEP转录的2.0kb条带，这一结果进一步验证了PEP活性的缺失。然而，在pdm1突变体中RpoA蛋白的积累量能够达到野生型的1/3，这表明L23-L2-S19-L22-S3-L16-L14-S8-L36-S11-rpoA转录剪切得到的其他转录本能够作为蛋白翻译的模板。为了了解PDM1是否结合在rpoA前体mrna上，我们利用PDM1-FLAG嵌合基因成功互补pdm1突变体的转基因植株，通过rna免疫共沉淀技术分析PDM1结合的rna序列。结果表明PDM1可能结合在S11-rpoA的基因间隔区，从而参与rpoA的加工。

关键词：拟南芥 PDM1 rna剪切 rpoA前体mrna

功能性核酸8-17 DNAzyme的活性调控

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功能性核酸8-17 DNAzyme的活性调控

作者：梁长城中国海洋大学

学位级别：硕士

功能性核酸是指除了作为遗传信息的载体等传统生物功能之外，具有催化活性、基因表达的调控、以及特异的结合能力等功能的核酸类分子。无论是生物体内天然存在的还是人工合成的，功能性核酸最近受到了越来越多的重视。特别是大量非表达... 详细信息

功能性核酸是指除了作为遗传信息的载体等传统生物功能之外，具有催化活性、基因表达的调控、以及特异的结合能力等功能的核酸类分子。无论是生物体内天然存在的还是人工合成的，功能性核酸最近受到了越来越多的重视。特别是大量非表达小rna和调控rna的发现使人们对核酸的认识发生了根本性的改变。而对于功能性核酸的活性控制研究较少，如果实现人为控制，将对我们了解功能核酸的作用机制以及通过控制核酸类药物的活性达到期待的疗效等有积极意义。脱氧核酶(DNAzyme)是近年来研究发现的有代表性的一类功能性核酸。具有剪切rna分子或DNA分子、T4聚核苷酸激酶样活性、DNA连接酶样活性以及催化卟啉金属离子化等多种生物催化功能。本文以8-17DNAzyme为例，探讨了通过控制DNAzyme的拓扑结构调控其rna剪切活性，旨在建立一个控制DNAzyme活性的模型，开拓通过引起拓扑结构的变化来调控功能性核酸活性的新思路。研究发现，用T4DNA连接酶将8-17DNAzyme连接成环后，其特异性催化rna磷酸二酯键水解的活性大大降低。而通过将8-17DNAzyme设计成一个大的发卡结构，拉近8-17DNAzyme两端也同样使其活性降低。通过限制性内切酶EcoR I切断发卡结构的双链Stem部位，使拉近的8-17DNAzyme两端远离后，rna剪切活性得到了恢复，实现了用一种酶的活性对另外一种功能性分子活性的控制。本研究达到了通过控制功能性核酸8-17DNAzyme的拓扑结构变化而对功能性核酸的活性进行调控的目的，初步建立了一个控制功能性核酸活性的模型。不但对于进一步研究脱氧核酶结构与功能的关系，开发其在基因分析、诊断及基因治疗等实际应用方面有重要意义，同时对于其他类型的功能性核酸的功能调控也具有十分重要的借鉴意义。

关键词： DNAzyme（脱氧核酸酶）拓扑结构活性调控 rna剪切

柯萨奇病毒B组3型基因组剪切片段的序列分析

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微生物与感染 2020年第4期15卷 206-212页

作者：汪颖楠依鸣徐维祯钟照华哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨150081

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组rna存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′cDNA末端快速扩增技术(5′rapid amplification of cDNA ends,5′RACE)扩增并克隆细... 详细信息

柯萨奇病毒B组(Coxsackievirus B,CVB)感染细胞时其基因组rna存在不稳定现象,但产生机制尚不清楚。本研究将柯萨奇病毒B组3型(CVB3)感染细胞后,利用5′cDNA末端快速扩增技术(5′rapid amplification of cDNA ends,5′RACE)扩增并克隆细胞内CVB3基因组片段,并对每条序列及其5′端的二级结构进行分析。结果获得的20条CVB3基因组片段,长度为2067~5547bp,片段断端主要分布于2Apro和2C编码区。rnafold分析显示,这些片段多数在5′断点端形成二级茎-环结构。本研究显示,CVB在宿主细胞感染时可形成大量不完整基因组rna片段,这些片段可在5′断点端形成局部双链结构,提示片段不是随机产生,可能是rna酶剪切产物。此发现有助于理解CVB基因组不稳定的机制。

关键词：柯萨奇病毒B组3型 rna剪切二级结构 5′cDNA末端快速扩增

乙型肝炎病毒polyA形成与调节因素研究进展

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中国病毒病杂志 2011年第6期1卷 412-415页

作者：关武祥杨东亮斯托瓦斯医学研究所华中科技大学同济医学院附属协和医院感染病学教研室湖北武汉430030

乙型病毒性肝炎（乙肝）是全球范围的重大公共卫生问题之一,其病原体乙型肝炎病毒（HBV）可通过多种途径感染人体,引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV感染是全球十大死因之一,世界上30%的人感染过或者成为HBV的携带者。据统计... 详细信息

乙型病毒性肝炎（乙肝）是全球范围的重大公共卫生问题之一,其病原体乙型肝炎病毒（HBV）可通过多种途径感染人体,引起急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌。HBV感染是全球十大死因之一,世界上30%的人感染过或者成为HBV的携带者。据统计[1],全球共有3.5亿HBV慢性感染者,每年因HBV慢性感染所致的肝纤维化或者肝癌感染致死的人数有100万左右。

关键词：乙型肝炎病毒 rna转录 rna剪切 3′末端形成