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rna病毒感染组织标本保存方法探讨

RNA病毒感染组织标本保存方法探讨

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作者：贺莉萍武汉大学

学位级别：硕士

目的：探讨固定剂、固定时间及温度对rna病毒感染组织总rna的完整性、得率及病毒rna扩增的影响。以及固定剂和固定时间对石蜡包埋组织中rna降解和标本病理形态学的影响。方法：取汉坦病毒76—118株接种乳鼠的感染组织，以沉淀脱水类固... 详细信息

目的：探讨固定剂、固定时间及温度对rna病毒感染组织总rna的完整性、得率及病毒rna扩增的影响。以及固定剂和固定时间对石蜡包埋组织中rna降解和标本病理形态学的影响。方法：取汉坦病毒76—118株接种乳鼠的感染组织，以沉淀脱水类固定剂100％甲醇、75％乙醇、100％丙酮以及醛类固定剂4％的多聚甲醛磷酸缓冲液(4％PFA)、10％福尔马林共五种固定剂，分别在4℃和室温下固定病毒感染组织6h、12h、24h和48h后，对固定后标本进行如下检测或处理：1、从固定6h～48h后的标本中直接提取组织总rna，用琼脂糖凝胶电泳检测rna完整性;以分光光度计测吸光度计算组织总rna得率;用巢式RT—PCR扩增病毒rna序列，电泳检测PCR产物并行灰度扫描。对rna得率及PCR产物电泳所测灰度值进行统计学分析。2、将固定后的病毒感染组织标本进行石蜡包埋长期保存。对石蜡包埋组织切片后HE染色，镜下观察各种固定剂对组织病理形态学的影响。从长期保存的各种方式固定后石蜡包埋组织中以RT—PCR扩增出不同片段长度的病毒rna及β-actin rna序列，以获得产物最大长度或对长片段扩增的可重复性及假阴性的多少，来反映各种固定方式对病毒rna和细胞总rna降解的影响。结果：1、病理切片结果显示，经10％福尔马林和4％PFA固定的石蜡切片，组织结构完整清晰。其他三种沉淀脱水类固定剂固定后组织有不同程度收缩，但不影响组织病理形态学检测，其中甲醇固定的收缩程度最小。 2、固定标本直接提取rna结果，(1)rna完整性：与立即冰冻或新鲜组织比较，100％甲醇固定24h，rna完整性损伤不明显;75％乙醇、100％丙酮固定12h后rna开始出现损伤带，24h出现明显的损伤;而10％福尔马林、4％PFA固定6h就开始出现明显的损伤，固定24 h几乎很难看清rna条带。(2)rna得率析因分析结果显示，不同固定剂、固定时间、固定温度下固定的组织中所提rna的得率有显著性差异(P＜0.01)，沉淀类固定剂固定后组织rna得率明显高于醛类固定剂(P＜0.01);三种沉淀类固定剂之间差别无统计学意义伊>0.01);4%PFA高于10%福尔马林 (Prna得率最高，10%福尔马林在室温下固定48h得率最低。(3)固定后标本巢式RT一PCR，除10%的福尔马林固定48h后扩增结果不稳定外，其余各固定方式均能扩增出特异性带。对电泳结果进行灰度扫描时，甲醇、乙醇和丙酮固定的标本中扩增的产物电泳条带更亮，灰度值更高伊石蜡包埋组织中提取rna进行RT一PCR扩增时，扩增的效果受固定剂类型、固定时间及固定过程的温度的影响，同时也受扩增的基因片段长度的影响。在可达到固定作用的前提下，同一固定剂固定时间越短，RT一PCR扩增结果越稳定。采用相同的固定时间，从甲醇、乙醇及丙酮等沉淀类固定剂固定石蜡包埋的病毒组织中扩增出病毒rna的阳性结果比醛类剂高，重复性好。尤其在在进行长片段扩增时，假阴性现象比醛类固定剂固定的标本少。各种沉淀固定剂之间无明显区别。结论:1、固定剂类型、固定温度及固定持续时间的不同对病毒感染组织标本的保存产生明显的影响。2、甲醇、75%乙醇及丙酮三种沉淀脱水类固定剂固定感染组织后虽产生一定的收缩效应，但不影响镜下形态学的观察。对核酸完整性的保存明显优于醛类固定剂。与醛类固定剂相比，沉淀类的三种固定剂可保存分子量相对高的rna。 3、RT一PCR从甲醇、丙酮及70%乙醇固定后保存的石蜡包埋组织中扩增效果明显优于甲醛类固定标本。4、在临床或流行病现场采样时，可选用沉淀类固定剂，尤其推荐用甲醇，以替换醛类固定剂。对病毒感染组织固定时间不宜偏长，固定过程的温度宜选用4℃。5、在对存档的石蜡包埋组织作回顾性研究，解释其PCR阴性结果时，必需考虑组织标本固定对rna分子的影响。

关键词：组织保存 rna,病毒,流行病学,分子,石蜡包埋组织

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